类器官培养技术在呼吸系统疾病中的应用_李晓娜.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（2）：366-372杂志网址：http:/类器官培养技术在呼吸系统疾病中的应用*李晓娜，齐先梅，张田甜，王婧（中国医学科科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院，北京 100010）Application of organoid culture technology in respiratory diseasesLI Xiaona，QI Xianmei，ZHANG Tiantian，WANG Jing（Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences，School of Basic Medicine Peking Union Medical College，Beijing 100730，China.E-mail：）ABSTRACT Organoid culture is a new biological technology，with significantly higher success rates and lower costs compared with the traditional 2D culture techniques.Organoids provide a new model for the study of organ development and disease as well as drug discovery.In this review，the research progress of organoids in respiratory diseases，such as lung cancer，pulmonary fibrosis and pulmonary infectious diseases，is summarized，and prospects of organoid application are discussed for the further study of respiratory diseases.关键词 类器官；呼吸系统疾病；干细胞KEY WORDS organoids；respiratory diseases；stem cells中图分类号 R-33；R318.13；R56 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.020呼吸系统主要负责人体与外界的气体交换，包括上呼吸道和下呼吸道。上呼吸道由鼻、咽和喉组成，下呼吸道从近端到远端由气管、支气管、细支气管和肺泡组成。气管和支气管由假复层纤毛柱状上皮、基底细胞、杯状细胞和棒状细胞组成；细支气管除了上述细胞外，还有肺神经内分泌细胞；肺泡则主要由肺泡I型上皮细胞（alveolar type I cells，AT1）和肺泡II型上皮细胞（alveolar type II cells，AT2）组成。AT1扁而宽大，参与构成气-血屏障；AT2为立方形或圆形，主要功能为分泌表面活性物质，降低肺泡表面张力，维持肺泡形态。呼吸系统的病变会导致多种临床症状：咳嗽、气喘、呼吸困难、呼吸衰竭、胸痛等，给患者带来严重负担。类器官，又称3D组织培养物，是由体外干细胞生长而成的三维组织衍生物，具有特定器官的多种关键细胞类型和相似的组织结构，可以重现该器官的功能。更多的数据证明，相比传统的2D细胞培养模式，3D细胞培养更能模拟体内的组织情况，在结构和细胞信号传导方面都与体内情况更加相似，在作为疾病模型进行分子机制研究和药物分析、甚至发展再生器官移植方面都有着巨大的潜力1。类器官的概念最早在 1946 年提出，用于描述囊性畸胎瘤2。2009年，Sato等3利用Lgr5+上皮细胞培养出无间质隐窝-绒毛结构类器官，此后，这一技术飞速发展，建立了多种肠道疾病模型，例如肠癌、小肠囊性纤维化、小肠感染性疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎等，为相应的疾病研究提供了坚实的基础。在这篇综述中，我们将对近年来类器官的发展及其在肺癌、肺纤维化和肺部感染性疾病的研究进展做出总结，为今后类器官在呼吸系统疾病中的应用提供理论依据。1 肺类器官的发展历程2012年，Wong等4第一次描述了使用气液界面培养的方法，由诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）培养出肺类器官。2015 年，Dye等5报道了由人类多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs），包括胚胎多能干细胞（embryonic pluripotent stem cells，ESCs）和iPSC，培养出了人肺类文章编号 1000-4718（2023）02-0366-07 收稿日期 2022-07-15 修回日期 2022-10-12*基金项目 国家重点研发计划（No.2021YFC2500700）；中央级公益性科研院所基本科研业务费（No.2021RC310002）通讯作者 Tel：010-69156477；E-mail：366器官（human lung organoids，HLOs），在培养过程中干细胞经历了内胚层-前肠内胚层-腹侧前前肠球体各个阶段。它的组织结构与肺类似，拥有近端气道的结构和远端气道的上皮结构，包括气道样上皮、基底细胞、未成熟的纤毛细胞、包裹上皮细胞的肌成纤维细胞和平滑肌细胞，还有未成熟的肺泡样区域，类似于胎儿肺，可用于研究肺发育及作为疾病模型。2017年，Tan等6第一次尝试以成人来源的细胞培养类器官，该研究证明，将成人的支气管上皮细胞、肺成纤维细胞和肺微血管内皮细胞放置在恰当的三维组织培养环境中，细胞将迅速自排列成为离散的上皮和内皮结构，且在结构与功能上具有稳定性。2019年，Miller等7通过将hPSCs进行3个阶段的培养，获得了肺芽类器官与肺类器官。2020年，Salahudeen等8通过人肺组织获得成体干细胞，培养出了肺类器官。2 肺类器官的培养方法类器官的细胞来源有两个方面，一是多能干细胞，包括ESCs以及iPSCs，通过添加不同的细胞培养基、基质胶、细胞因子、小分子化合物诱导其向特定器官的方向进行分化，经各个发育阶段后分化为各种细胞；二是成体干细胞，包括基底细胞、分泌细胞和AT2。从组织活检或手术切除的标本中取出部分组织，在相应环境下直接培养，使其生长为与其来源类似的组织结构，该方法培养的类器官与干细胞来源类器官的形态和功能相似。2.1胚胎干细胞来源肺类器官的培养方法由胚胎干细胞培养得到肺类器官需要3个阶段。第一阶段hPSCs经Activan A培养4 d后向内胚层分化；第二阶段改用 Noggin、SB431542、SMO 激动剂、FGF4 和CHIR99021处理 3 d，前肠形成前肠球体；第三阶段将球状的前肠球体分离至两种不同条件的基质胶滴，即将基质胶滴在培养皿形成的半球结构状培养基中培养，分别形成肺类器官与肺芽类器官。前肠球体在添加FBS与FGF10的基质胶中培养得到肺类器官，其具有气道样结构、周围间质和肺泡祖细胞。前肠球体在添加 FGF7、ATRA、CHIR99021 和 Step 20B的基质胶中培养得到肺芽尖类器官，针穿处理得到均质的肺芽尖端祖细胞，未针穿处理得到具有远端-近端之分的肺芽状结构7。2.2成体干细胞来源肺类器官的培养方法机械分离距离脏胸膜1 cm处的人肺组织，用猪弹性蛋白酶，脱氧核糖核酸酶和Normocin洗涤孵育，得到成体干细胞，在添加N-乙酰半胱氨酸、1 B27、NOGGIN（BMP拮抗剂）、EGF和TGF-抑制剂A83-01的DMEM/F12培养基中培养，经搅拌、过滤、裂解红细胞等步骤后，用10倍体积的降生长因子基底膜提取物重悬，将混悬液以50 L液滴置于24孔板。单细胞测序显示培养出的细胞包括SFTPC+的AT2细胞、KRT5+的基底细胞、SCGB1A1+的Club细胞。以初始细胞分裂率计算，培养的基底肺类器官扩张上限为 219（524 288倍），肺泡扩张上限为216（65 536倍）8。Zhang等9分离小鼠原代肺泡细胞，使用SV40大T抗原的逆转录病毒进行处理，产生非致瘤性且保持长期活性的肺泡细胞，进一步筛选AT2亚群，建立肺类器官，证明其能具有AT2细胞特性，可用于建模肺部疾病。3 类器官在呼吸系统疾病中的应用由于类器官具有多种细胞类型及部分组织结构，它被广泛的应用于各类疾病的研究。而在呼吸系统中，主要应用于肺癌、肺部感染性疾病、肺纤维化疾病中。肺类器官用于呼吸系统疾病的机制及药物筛选的相关研究，对进一步对这些疾病有更深刻的认识，提供了有力的支撑。3.1类器官在肺癌中的应用肺癌是最常见的癌症，也是男性癌症的主要原因，肺癌有多种类型，突变模式也多种多样，这使得肺癌的研究与治疗具有很大的难度。目前，在癌症研究领域应用的体外疾病模型主要有2D细胞培养癌细胞株、人源肿瘤异种移植模型（patient-derived tumor xenograft，PDXs）和肿瘤类器官（patient-derived organoids，PDOs）。癌细胞株具有操作简单、成本较低的优点，但由于其采用细胞二维培养的方式，使得肺癌的异质性这一复杂特征得不到体现。PDXs是通过将患者肿瘤移植到免疫缺陷小鼠中得到的，在组织结构上对原发性癌症有着很大程度的还原，但由于其成本高昂、建模周期长且成功率不高而有所限制。目前，类器官已投入到多种癌症的研究中，包括胃肠癌10、膀胱癌11、乳腺癌12等。PDOs是将患者癌组织培养成相应的组织团块，与PDXs相比有它不可替代的优势：即建模成功率更高、建模时间更快以及成本更低。Weeber等13研究证实，PDOs在至少大块癌症组织的DNA水平上表现出原发肿瘤的特点；Sato等14发现，PDOs除了构建时间较短外，在长时间的扩张下依然能保持遗传和形态上的稳定。这些发现为肿瘤类器官的应用提供了可靠的依据。Kim等15通过开发一种由于缺乏Wnt3a和Noggin而抑制正常细胞生长的基本培养基，创建了80个肺癌类器官样本库，包括5种肺癌亚型（腺癌、鳞癌、小细胞癌、腺鳞癌和大细胞癌）。这些肺癌类器官（lung cancer organoids，LCOs）维持着亲本癌组织的遗传特征，在HE染色与免疫组化分析中表现出与亲本癌组织相似的形态及组织结构，也能367够表达对应各自组织类型的肿瘤标志物，且形态学在培养长达超过6个月的情况下都没有发生任何变化，进一步采用小的活检组织也得到了相应的LCOs，证明临床样本也可以培养产生类器官。此外，将23个患者的上皮细胞样本同时进行2D细胞培养PDXs与LCOs，结果显示2D细胞培养成功率最高（100%），LCOs培养的成功率（87%）高于PDXs（3%），但LCOs培养所需时间（4周），明显短于PDXs（36月），总的来说，从建模成功率、建模时间、建模成本三个方面，肺类器官优势明显15。不仅如此，将PDOs移植到免疫缺陷小鼠体内时，依然能够成功构建PDXs。此外，除了肺癌造模方面的优势，肺类器官在肺癌的机制研究中也做出了相应的贡献：Lazarus等16开发了一种敲除Bcl11a基因的基底细胞的肺类器官，并且证明了Bcl11a是一种鳞癌基因。在药物研究方面，具有人体生理结构，并且可由患者组织直接培养的肺类器官具有筛选治疗药物的作用17。源于患者的肺类器官可以作为药物高通量筛选或个体化用药的药物效果检测手段18。肺类器官与其他新技术的结合也使研究方法更为多样化：Hai 等19使用 CRISPR-Cas9技术对小鼠来源的肺类器官进行基因重编辑，删除多个肿瘤抑制基因，通过与患者来源的细胞系进行比较，发现其在基因与表型水平上与人类肺鳞状细胞癌相接近，并以此模型阐明免疫检查点阻断与DNA损伤诱导疗法治疗人类肺鳞状细胞癌的假说。相比2D细胞与PDXs，PDOs无疑是更为理想的癌症模型，但是在指导临床决