梨火疫病病原菌的分离鉴定及室内抑菌药剂筛选_陈晓晓.pdf

西 北 农 业 学 报 2 0 2 3,3 2(3):4 6 8-4 7 8A c t aA g r i c u l t u r a eB o r e a l i-o c c i d e n t a l i sS i n i c ad o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 3.0 1 5h t t p s:/d o i.o r g/1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 3.0 1 5梨火疫病病原菌的分离鉴定及室内抑菌药剂筛选收稿日期:2 0 2 1-1 2-0 8 修回日期:2 0 2 2-0 4-1 1基金项目:国家自然科学基金(3 1 8 6 0 4 7 7);3%、1 2%噻霉铜水分散粒剂防治梨树苹果枝枯病药效试验(2 5 2 0 HX K T 7)。第一作者:陈晓晓,女,硕士研究生,研究方向为资源利用与植物保护。E-m a i l:i q n 2 l a y e a h.n e t通信作者:刘 琦,男,博士,副教授,研究方向为植物病害流行学。E-m a i l:l i u q i x j a u.e d u.c n陈 晶,女,博士,讲师,研究方向为植物检疫与生态健康。E-m a i l:c j-y x 2 0 0 41 6 3.c o m陈晓晓,艾尼赛赛米,粟神强,贾玉凤,刘 琦,陈 晶(新疆农业大学 农学院,农林有害生物监测与安全防控重点实验室,乌鲁木齐 8 3 0 0 5 2)摘 要 为明确新疆库尔勒地区梨火疫病致病菌,并筛选有效防治药剂。采用平板划线法获得分离物,结合致病性测定、形态学特征与分子生物学技术综合鉴定致病菌,采用“药液-菌液共培养法”与“抑菌圈法”测定1 6种杀菌剂对其室内毒力。鉴定分离物为E r w i n i aa m y l o v o r a。1 6种杀菌剂对梨火疫病菌均有抑制作用。其中,0.3%四霉素A S抑菌效果最好,E C5 0为2.9 6 8g/m L。研究结果对梨火疫病田间药剂防治提供科学依据。关键词 梨火疫病;病原鉴定;杀菌剂;毒力测定;药剂筛选 中国是全球栽培梨的三大起源中心之一1。梨在中国是仅次于苹果、柑橘的第三大水果2,且随着近年来农业结构调整的深入和加快,各地梨果产业经济快速发展3。新疆作为中国梨果产业的重要产区,2 0 2 0年库尔勒香梨种植面积约3.0 9万h m2,总产量为4 0.2 7万t4,香梨种植规模逐年扩大5。库尔勒香梨作为新疆地区特色林果树种,是当地农民增收的主要渠道6。但近年来,受检疫性、细菌性病害梨火疫病的影响7,库尔勒香梨产 业 的 发 展 被 严 重 制 约。该 病 由E r w i n i aa m y l o v o r a侵染所致,因侵染情况复杂8,传播速度快,传播途径多,寄主范围广,故其致病菌被称为全球十大植物病原细菌之一9。在化学药剂防治方面,国外因长时间使用农用链霉素导致菌株产生抗药性1 0。在中国由于农用链霉素产品已全部退出市场1 1,加之中国梨树多为梨火疫病感病品种1 2,导致该病害潜在为害流行风险极高。因此,寻找更加高效、快速的替代药剂迫在眉睫1 3。本试验通过从新疆库尔勒地区不同梨园采集的疑似梨火疫病病枝、病叶进行病原物分离、纯化、形态学特征鉴定、致病性检验、分子鉴定和室内毒力测定,以期鉴定出新疆库尔勒地区疑似梨火疫病病原菌及筛选出防治该病的室内有效药剂,为田间防控梨火疫病提供科学依据。1 材料与方法1.1 梨火疫病菌的分离纯化、致病性测定和菌种保存1.1.1 供试材料 采自新疆库尔勒地区不同梨园梨树上的疑似病枝、病叶。1.1.2 分离纯化 采用平板划线法1 4与N S A选择性培养基1 2进行分离纯化。剪取样品病健交界处0.5c m2组织块,置于7 5%酒精中表面消毒3 0s,1%次氯酸钠中表面消毒6 0s,无菌水冲洗3次后将组织块剪碎放置培养皿中,倒入无菌水浸泡3 0m i n。用接种环蘸取悬浮液在N S A培养基上进行三区划线分离,后置入2 8恒温培养箱内培养4 8h,待菌落长出后,挑取颜色、形态一致的单菌落在NA培养基上进行纯化培养。1.1.3 形态学特征 将供试菌株接种于N S A选择性培养基进行分离培养3 64 8h1 5,N S A选择性培养基由蔗糖作为碳源,利用梨火疫病病原菌在高浓度蔗糖条件下的果聚糖反应,及蔗糖产酸使培养基中的染料变色,产生了高度隆起且光滑的橘红色菌落,据此可初步判断为梨火疫病原菌。而后在NA培养基和N B培养液中纯化培养3 64 8h,观察菌落的形态、大小、颜色、生长状况及边缘特征等。1.1.4 致病性测定 将分离纯化后的菌株接种到健康的梨树离体叶片与海棠树离体叶片上进行致病性测定验证。采摘杜梨苗枝条上4周龄以上、35c m处的嫩叶,海棠枝条上48c m处的叶片,用无菌水洗净晾干,置于9 0mm培养皿中,在正面距离叶片12c m的叶柄处,采用针刺接种,并用无菌水沾湿脱脂棉,放置培养皿底部,每天滴加无菌水进行保湿处理。置入2 8 培养箱恒温培养7d,观察发病情况,对发病叶片进行病原菌的再分离与鉴定。1.1.5 分子生物学验证 根据尚琳琳等1 6已报道的检测梨火疫病菌方法,利用北京博迈德基因技术有限公司合成的特异性引物P 2 9 F(5 -g g gC AA AT A C T C g g A T T-3)、P 2 9 R(5 -C g gT T TT T A A c gC T gg g-3),将回接纯化后的单菌落作为D NA模板,制作2 5L反应体系:2T AQ M I X:1 3L;d d H2O:1 0L;上 游 引 物P 2 9 F:1L(1 0m o l/L)、下游引物P 2 9 R:1L(1 0m o l/L),而后进行P C R扩增反应,反应程序为:预变性9 4 3m i n;变性9 4 3 0s,退火5 53 0s,延伸7 29 0s,4 0个循环;最后7 2延伸5m i n。以d d H2O为阴性对照,以已知梨火疫病菌为阳性对照,经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,胶回收送至上海生工公司测序。1.1.6 菌种保存 将经过验证鉴定为梨火疫病病原菌的菌株在NA培养基上进行平板划线分离培养,2 8恒温培养3 6h后得到单菌落,挑取单菌落 置 于2 5 m L的N B培 养 液 中,2 8、1 8 0r/m i n的恒温震荡培养1 2h,用分光光度计测定O D6 0 0值为1.01.2的菌悬液作为试验菌液。用配置好的8 0%丙三醇和试验菌液按11比例加入冷冻管内,混匀。-2 0 冷冻短 期保存,-8 0冷冻长期保存。1.2 室内毒力测定1.2.1 供试药剂 本研究共测试1 6种药剂。药剂名称、剂型、生产厂家详情见表1。1.2.2 供试菌株 梨火疫病菌株E.a0 1由新疆农业大学植物病害流行研究室从新疆库尔勒地区不同梨园采摘的疑似病样(枝、叶)中分离、鉴定并保存。1.2.3 试验方法 采用“药液-菌液共培养法”与“抑菌圈法”两种方法进行室内毒力测定。药液-菌液共培养法:在NA培养基上将保存菌种进行划线分离,2 8 恒温培养4 8h,并二次活化获得单菌落。将单菌落转入N B培养液中2 8、1 8 0r/m i n继续恒温震荡培养1 2h,测定O D6 0 0值为1.01.2时得到试验菌悬液,并置于4冷藏,备用。按照表1中的有效成分质量浓度梯度,将各杀菌剂依照不同稀释倍数分别加入到5 0m L无菌水中制成药液,备用。并按2 0m L药液+2m L菌悬液+2 0m LN B培养液的体系混合,在2 8、1 8 0r/m i n恒温震荡器中培养4h制成混药菌悬液。将不同浓度的混药菌悬液依次按照11 0-6C F U/m L稀释,吸取1 06试管中1 0 0L的液体涂布于NA培养基中至干燥。各药剂5个浓度,每个浓度重复3次,无菌水组为对照。2 8下倒置培养3 6h,记录各培养皿中的单菌落个数,并按计算抑菌率。抑菌圈法:试验菌悬液的制作与“药液-菌液共培养法”中的一致,并将该菌悬液进行11 0-4C F U/m L稀释,吸取1 04试管中1 0 0L的菌悬液涂布于NA培养基中至干燥。取直径为6mm的灭菌滤纸片以等边三角形形式置于平板培养基上,每皿3片。将不同杀菌剂按照表1中的有效成分质量浓度分别加入到5 0m L无菌水中制成药液备用。吸取6L不同质量浓度的药液滴于纸碟上。各药剂5个浓度,每个浓度重复3次,无菌水组作为对照。2 8下正置培养3 6h,使用十字交叉法测量抑菌圈直径大小,按下式计算抑菌率。抑菌率=药剂处理抑菌圈直径-清水对照抑菌圈直径药剂处理抑菌圈直径 1 0 0%以E C5 0值最大药剂为标准药剂,按下式计算各杀菌剂的相对毒力指数1 7。相对毒力指数=标准药剂E C5 0值供试药剂E C5 0值1 0 01.3 数据处理数据采用M i c r o s o f tE x c e l 2 0 1 9统计整理,计算各药剂相对毒力指数、毒力回归方程(y=a x+b)及相关系数(R2)。使用S P S S2 6.0计算供试药剂的E C5 0值。2 结果与分析2.1 致病菌鉴定2.1.1 病原菌的形态学鉴定及培养性状 通过划线分离,从病害标本上获得纯化菌株,编号为E.a 0 1。如图1所示,菌落在N S A选择性培养基生长2 44 8h后,形成橙红色、中心颜色较深的半球状菌落,且高度隆起,边缘整齐,整体光滑。菌落在NA培养基生长2 44 8h后,形成乳白色9643期陈晓晓等:梨火疫病病原菌的分离鉴定及室内抑菌药剂筛选半球状菌落,且整体隆起,边缘整齐,表面光滑,相较于生长在N S A选择性培养中的单菌落要小。菌落在N B培养液中生长旺盛,菌液浑浊呈云雾状。2.1.2 致病性测定结果 将纯化后的梨火疫病菌E.a0 1接种到健康的离体杜梨叶片和离体海棠叶片上,回接2 4h后,两种叶片肉眼可见针刺处发黑。4 8h后,病菌从叶柄向叶脉处运动,两种不同植物的叶柄已全部被侵染。回接3d后,两种叶片上的病斑逐渐从叶脉向叶片延伸,海棠叶片侵染速度较杜梨叶片快。4d后,病菌已侵染至杜梨叶脉三分之一处,海棠叶脉被侵染至二分之一处。回接5d与6d后,海棠叶片已逐渐枯黄萎蔫,两者叶片均出现大面积的黑褐色火烧状坏死,与田间发病症状相同,清水对照组的叶片未观察到发病症状,详情见图2。表1 供试杀菌剂试验设计T a b l e1 E x p e r i m e n t a l d e s i g no fb a c t e r i c i d e s处理T r e a t m e n t通用名称F u n g i c i d e剂型D o s a g e f o r m生产厂商M a n u f a c t u r e r稀释倍数D i l u t i o nm u l t i p l e质量浓度/(g/m L)M a s sc o n c e n t r a t i o n1-10.3%四霉素T e t r a m y c i n0.3%水剂A q u e o u ss o l u t i o n,A S辽宁微科生物工程股份有限公司L i a o n i n gWk i o cB i o e n g i n e e r i n gC o.,L t d62 5 00.51-231 2 511-36 0 251-43 0 11 01-56 05 02-12%春雷霉素K a s u g a m y c i n2%水剂A q u e o u ss o l u t i o n,A S江门市植保有限公司J i a n g m e nP l a n tP r o t e c t i o nC o.,L t d33 0 062-225 0 082-317 0 01 1.62-49 0 02 22-51 0 02 0 03-12%春雷霉素K a s u g a m y c i n2%水剂A q u e o u ss o