来源于生孢噬纤维菌的新型β...酶SmBgl3A的性质研究_费嵩禹.pdf

研究论文2023年第42卷第1期食品与生物技术学报费嵩禹，等：来源于生孢噬纤维菌的新型-葡萄糖苷酶SmBgl3A的性质研究Characterization of a Novel-glucosidase SmBgl3A fromSporocytophaga sp.CX11FEI Songyu，WANG Ziyi，JING Xiaofeng，YANG Fan，CHEN Xiaoyi*，LI Xianzhen（School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）Abstract：A-glucosidase gene SmBgl3A,which might play a key role in cellobiose degradationand utilization,was screened from Sporocytophaga sp.CX11 genome through the analysis andcomparison of expression level.The gene contains 2 283 bp and encodes 760 amino acids.Theencoded protein of SmBgl3A has 46.76%homology with the-glucosidase BoGH3B fromBacteroides ovatus.The gene SmBgl3A was heterologously expressed in Escherichia coli.Theelectrophoretically pure recombinant protein SmBgl3A was achieved by the purification of crudeenzymes using Ni-NTA affinity chromatography,and the relative molecular weight of recombinantprotein was consistent with the theoretical value(8.12104).Characterization of enzymatic propertiesshowed that the optimum temperature and pH of SmBgl3A were 35 and 6.5,respectively.When摘要：通过表达水平分析比较，从生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11基因组中筛选出在菌株降解纤维二糖过程中起关键作用的-葡萄糖苷酶基因SmBgl3A。该基因含有2 283 bp碱基对，编码760个氨基酸，其编码蛋白质与来源于Bacteroides ovatus的-葡萄糖苷酶BoGH3B同源性为46.76%。将该基因在大肠杆菌中进行异源表达，粗酶液经Ni-NTA亲和层析一步纯化得到电泳级纯度的酶蛋白SmBgl3A，重组蛋白质相对分子质量与理论值（8.12104）一致。酶学性质表征结果表明，SmBgl3A最适温度和pH分别为35 和6.5；pH在5.07.0、温度在40 以下时，稳定性较好，同时有着较好的NaCl耐受性。SmBgl3A的最适底物为pNPG，以pNPG为底物时的比活力高达14.74 U/mg；Km值为10.88 mmol/L，kcat值为46.72 s-1。SmBgl3A作为一种新型的、酶学性质优良的-葡萄糖苷酶，进一步扩展了-葡萄糖苷酶的种类，为该酶在纤维素降解、食品工业等领域的应用奠定基础。关键词：-葡萄糖苷酶；GH3家族；生孢噬纤维菌CX11；异源表达；酶学性质中图分类号：Q 814文章编号：1673-1689（2023）01-0083-10DOI：10.3969/j.issn.1673-1689.2023.01.007来源于生孢噬纤维菌的新型-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的性质研究费嵩禹，王梓懿，荆晓凤，杨 帆，陈晓艺*，李宪臻（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连116034）收稿日期：2021-12-06基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（31801469）；辽宁省自然科学基金项目（2020-MS-276）。*通信作者：陈晓艺（1982），女，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事微生物资源与生物催化等方面的研究。E-mail：chen-研究论文83RESEARCH ARTICLEFEI Songyu，et al：Characterization of a Novel -glucosidase SmBgl3Afrom Sporocytophaga sp.CX11JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 Issue 1 2023the pH value was 5.07.0 and the temperature was below 40,SmBgl3A was stable.In addition,SmBgl3A showed good NaCl tolerance.The optimal substrate for SmBgl3A was pNPG,and thespecific enzyme activity with pNPG as substrate was 14.74 U/mg.Kmand kcatof SmBgl3A towardspNPG were 10.88 mmol/L and 46.72 s-1,respectively.SmBgl3A is a novel enzyme with excellentenzymatic properties,further expanding the kinds of-glucosidase and laying a foundation for theenzyme application in cellulose degradation,food industry and other fields.Keywords:-glucosidase,GH3 family,Sporocytophagasp.CX11,heterologous expression,enzymatic properties-葡萄糖苷酶（-glucosidase，EC3.2.1.21），又称-葡萄糖苷水解酶，是一种用于改善食品风味或生产活性单体成分的重要酶制剂，广泛应用于食品、药品、保健品等领域1。近年来，有关-葡萄糖苷酶在食品加工领域的应用备受关注，有研究表明，-葡萄糖苷酶是水解芳香前体物质，释放结合态糖苷配基的关键性酶，能够改善茶叶、果汁、果酒、面包等食品的风味，提升食品品质2。周小玲等研究发现，可利用-葡萄糖苷酶辅助提取茶叶中的天然产物3；刘芳舒等研究发现，-葡萄糖苷酶酶解增香能在较大程度上还原刺梨汁的天然香气4；孙爱东等研究发现，用-葡萄糖苷酶处理各类葡萄酒，能够使其香气更加饱和，感官品质明显提高5；钱超等研究发现，添加高产-葡萄糖苷酶的乳酸菌发酵葡萄汁酸面团，能够明显改善面包风味6。此外，-葡萄糖苷酶能够在纤维素的降解过程中解除纤维二糖对内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶的产物抑制，能够水解结合于非还原性末端的-葡萄糖苷键，同时释放出葡萄糖和相应的配基。-葡萄糖苷酶主要作用于-1，4糖苷键，此外还可以作用于-（1，1）、（1，2）、（1，3）、（1，6）糖苷键7。依据氨基酸序列的同源性和结构的相似性，已知的-葡萄糖苷酶被归为GH1、GH3、GH5、GH9、GH30和GH116等6个家族中7-10。近年来，关于微生物来源-葡萄糖苷酶的报道日益增多。相比于真菌，一些细菌来源的-葡萄糖苷酶热稳定性更强，但是产量较低。针对这些问题，研究者利用基因工程等手段，异源表达性能优越的-葡萄糖苷酶，以提高其产量11。生孢噬纤维菌是土壤中常见的好氧性纤维素分解细菌，对纤维素的降解能力十分强大。然而，由于生孢噬纤维菌不易分离纯化，研究难度较大，关于生孢噬纤维菌的纤维素降解机制尚不明确12。部分研究人员对生孢噬纤维菌中纤维素酶的特性进行了研究，Osmundsvag等从生孢噬纤维菌的发酵液上清液中检测到内切葡聚糖酶的酶活力13，刘东波等对生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.JL-01的纤维素酶进行了定位研究14。-葡萄糖苷酶在生孢噬纤维菌降解纤维素的过程中起着十分重要的作用，但至今还未有关于生孢噬纤维菌中-葡萄糖苷酶的报道。为了获得酶学性质优良的新型-葡萄糖苷酶，作者首次从生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11的基因组中筛选出在降解纤维二糖过程中可能发挥关键作用的-葡萄糖苷酶基因（SmBgl3A），将该基因克隆，在大肠杆菌中进行异源表达，并对其酶学性质进行了研究，为进一步扩展-葡萄糖苷酶的种类，及对其功能及应用的探索奠定了基础。1.1材料与试剂1.1.1菌株和质粒载体Sporocytophaga sp.CX11：作者所在实验室分离保存；大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5、大肠杆菌BL21（DE3）、质粒pET-28a（+）：中国科学院大连物理化学研究所赵宗保研究员课题组惠赠。1.1.2主 要 试 剂PrimerSTARHSDNAPolymerase、DNA Marker、Protein Molecular WeightMarker、PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Perfect RealTime）、Dpn I、Pst I、Sma I、rTaq DNA聚合酶等：大连宝日医生物股份有限公司产品；SanProp柱式DNA胶回收试剂盒、SanProp柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、考马斯亮蓝G250、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）等：生工生物工程股份有限公司产品；对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）：北京索莱宝科技有限公司产品；胰蛋白胨、酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司产品；RNA提取试剂盒：艾科瑞生物公司产品。材料与方法184研究论文2023年第42卷第1期食品与生物技术学报费嵩禹，等：来源于生孢噬纤维菌的新型-葡萄糖苷酶SmBgl3A的性质研究1.1.3培 养 基Sporocytophaga sp.CX11培 养 基（g/L）：NaNO30.5，MgSO4H2O 0.5，KCl 0.5，K2HPO41，FeSO40.01，葡萄糖（或纤维二糖）5。LB培养基（g/L）：酵母浸粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10。LLB（低盐LB）发酵培养基（g/L）：酵母浸粉5，胰蛋白胨10，NaCl 5。1.2主要仪器梯度PCR仪、高速冷冻台式离心机、电击转化仪：德国Eppendorf公司产品；LAS4000、AKTA蛋白质纯化系统：美国GE Healthcare公司产品；超滤装置：美国Millipore公司产品；超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司产品；安捷伦电泳分析仪：美国安捷伦科技有限公司产品；酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司产品；三层恒温摇床：伊孚森生物科技（中国）有限公司产品；电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司产品；ICS-5000离子 色 谱 仪：美 国 赛 默 飞 世 尔 科 技 公 司 产 品；LightCycler480实时荧光定量PCR仪：瑞士Roche公司产品。1.3实验方法1.3.1生 孢 噬 纤 维 菌 总RNA的 提 取将Sporocytophaga sp.CX11接种至10 mL葡萄糖或纤维二糖液体培养基中，30、200 r/min培养36 h制备种子液。种子液以体积比150接种量分别接种至以葡萄糖或纤维二糖为碳源的液体培养基中，培养至对数生长中前期。收集菌体，用无菌水反复洗涤，重悬至OD600为1.0，液氮速冻于-80 保