狂犬病病毒aG株假病毒的制备方法_张雨薇.pdf

张雨薇，等：狂犬病病毒aG株假病毒的制备方法收稿日期：2022-07-13基金项目：吉林省科技发展计划项目（20200201099JC）作者简介：张雨薇（1997-），女，硕士研究生，E-mail：通讯作者：韩德明（1979-），男，博士，副教授，E-mail：狂犬病病毒 aG 株假病毒的制备方法张雨薇，韩德明（长春理工大学生命科学技术学院，长春130022）摘要：基于 HIV 慢病毒包装系统建立了狂犬病病毒（RV）aG 株假病毒的制备方法。构建编码 RV aG 株糖蛋白（GP）的重组真核表达质粒 pCMV-aG-G，转染至 293T 细胞验证 GP 的表达。将 GP 表达质粒与假病毒包装质粒及绿色荧光蛋白（GFP）指示质粒共转染 293T 细胞进行假病毒包装，制备携带 GFP 报告基因与 aG 株 GP 的 RV 假病毒。结果表明，研究成功构建了编码 RV aG 株 GP 的重组真核表达质粒，其可在 293T 细胞中有较高表达；成功制备了具有细胞感染性的 RV aG 株假病毒。本研究有助于更安全、准确监测针对我国现用人狂犬病疫苗生产用 RV 固定毒 aG 株的中和抗体水平。关键词：狂犬病病毒；假病毒；aG 株；转染中图分类号：R373.9文献标志码：A文章编号：1672-9870（2023）01-0102-06Preparation Method of Rabies Virus aG Strain PseudovirusZHANG Yuwei，HAN Deming（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）Abstract：The preparation method of rabies virus（RV）aG strain pseudovirus was established based on HIV lentiviralpackaging system.The recombinant eukaryotic expression plasmid pCMV-aG-G encoding RV aG strain glycoprotein（GP）was constructed and transfected into 293T cells to verify the expression of GP.The GP expression plasmid，thepseudovirus packaging plasmid and the green fluorescent protein（GFP）indicator plasmid were co-transfected into 293Tcells for pseudovirus packaging；and the RV pseudovirus carrying the GFP reporter gene and aG strain GP was prepared.The results showed that a recombinant eukaryotic expression plasmid encoding RV aG strain GP was successfully con-structed in this study，which could be highly expressed in 293T cells；a cell-infectious RV aG strain pseudovirus was suc-cessfully prepared.This study contributes to safer and more accurate monitoring of neutralizing antibody levels against theimmobilized aG strain of RV used in the production of human rabies vaccines in China.Key words：rabies virus；pseudovirus；aG strain；transfection狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的可感染人类和其他温血哺乳类动物的急性传染病，临床表现为恐水、怕风、畏光、咽喉 肌 痉 挛、进 行 性 瘫 痪 等，病 死 率 高 达 100%。RV 属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）1，病 毒 颗 粒 呈 子 弹 状，大 小 约 为200 nm。RV 为单股负链、不分节段的 RNA 病毒，病毒基因组约为 12 kb，共编码 5 种结构蛋白：RNA 聚合酶（L）、磷蛋白（P）、核蛋白（N）、基质蛋白（M）和糖蛋白（G）2-3。G 蛋白是 RV 中唯一长春理工大学学报（自然科学版）Journal of Changchun University of Science and Technology（Natural Science Edition）Vol.46No.1Feb.2023第46卷第1期2023年2月糖基化并暴露在病毒颗粒表面的蛋白质，是 RV的主要保护性抗原，直接参与 RV 感染靶细胞。G 蛋白与病毒细胞嗜性和毒力密切相关，可诱导体液免疫产生 RV 中和抗体（Rabies virus-neutralizing antibody，RVNA），并刺激 T 细胞产生细胞免疫4。RV 最普遍应用的毒株包括巴斯德研究所的PV、PM 和 CVS 株，Flury 鸡胚减毒株，中国的 aG株和 CTN 株5。其中，RV 固定毒 aG 株是中国现用人狂犬病疫苗生产用毒株，来源于北京株6。RVNA 水平是评价疫苗接种后机体对病毒防御状况的重要指标，中国药典 三部（2020 版）中狂犬病疫苗效力检测所用毒株为 WHO 规定的标准攻击毒 CVS-11 株7。由于不同疫苗株之间的抗原位点结构以及疫苗接种后血清中和抗体的抗原识别位点均存在差异，可能会影响中和抗体与检测用病毒株的中和反应程度，从而影响疫苗效价的检测结果8-9。假病毒是由病毒包膜蛋白或衣壳蛋白嵌合在反转录病毒基因组编码的骨架蛋白上一种具有单轮感染能力的重组病毒颗粒10-11。假病毒核酸分子上编码包膜蛋白或衣壳蛋白的基因通常被报告基因修饰取代，由于核酸缺陷性，其丧失了病毒的自我复制能力，因此具备很高的生物 安 全 性，使 其 可 以 在 生 物 安 全 二 级 实 验 室（BSL2）或普通实验室中开展检测活动。假病毒易于体外制备，且病毒滴度较高、稳定性好，可实现高通量快速检测12-14，使其广泛应用于血清学筛选、疫苗效力评估、基因转导等病毒学研究。目前，假病毒已成功应用于多种包膜病毒的研究，如埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）、丙 型 肝 炎 病 毒（Hepatitis C virus，HCV）及流感病毒（Influenza virus，IV）等15。利用上述特点，本研究构建了编码 RV aG 株G 蛋白的重组真核表达质粒 pCMV-aG-G，转染至 293T 细胞验证 G 蛋白的表达，将 G 蛋白表达质粒与假病毒包装质粒及 GFP 指示质粒共转染293T 细胞进行假病毒包装，制备携带 GFP 报告基因与 aG 株 G 蛋白的 RV 假病毒，并将其感染293T 细胞，通过观察 GFP 的表达验证其感染性。1实验部分1.1试剂与仪器仪器：PCR 仪、Trans-Blot SD 半干转印槽、凝胶成像分析仪（Bio-rad，美国）；台式高速离心机（Thermo Fisher Scientific，美国）；电泳仪（北京六一仪器厂，中国）；恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司，中国）；荧光显微镜（Nikon，日本）。试剂：RT-PCR 试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、慢病毒浓缩试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，中国）；限制性内切酶 EcoR、Bgl、T4 DNA 连接酶（莫纳生物科技有限公司，中国）；脂质体核酸转染试剂（翌圣生物科技有限公司，中国）；HIV 假病毒包装体系，包含pPL1、pPL2 和 pEmGFP 三种质粒（北京嘉美臻元生物技术有限公司，中国）；增强型 DAB 显色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，中国）；HRP 标记的羊抗小鼠 IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，中国）；RV aG 株 G 蛋白单抗、HIV-1 核衣壳蛋白 P24 单抗由长春生物制品研究所有限责任公司生物技术研究室保存。1.2实验过程1.2.1引物设计及合成根据 Genbank 中登录的 RV aG 株（accession：GQ412744）全基因序列，应用 Primer Premier 5.0软件设计引物，分别为 G 基因特异性扩增引物aG-GF 和 aG-GR，并在引物 aG-GF 的 5 端以及aG-GR 的 5 端 分 别 引 入 EcoRI 和 Bgl 酶 切 位点，引物由吉林省库美生物科技有限公司合成，引物为：上 游 引 物 aG-GF：5-GCGAATTCACCATGGTTCCTCAAGCTCTTTT-3（下划线部分为 EcoRI张雨薇，等：狂犬病病毒aG株假病毒的制备方法第1期103长春理工大学学报（自然科学版）2023年酶切位点）下游引物 aG-GR：5-TAAGATCTTCACAGTCCAGTCTCACC-3（下划线部分为 Bgl酶切位点）1.2.2目的基因的克隆采用 Trizol 法提取 RV aG 株全病毒灭活原液的 RNA，RT-PCR 试剂盒反转录获取 cDNA，以合成的 cDNA 为模板，PCR 扩增 G 基因。反应体系为：cDNA 1 L、5FastPfu Buffer 10 L、2.5 mmol/L dNTP 4 L、aG-GF 和 aG-GR 各 1 L、FastPfuDNA Polymerase 1 L、Nuclease-free Water 32 L，共 50 L；PCR 反应条件为：95 预变性 5 min；95 30 s，58 30 s，72 1 min，共 35 个循环；72 终延伸 10 min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.3重组真核表达质粒 pCMV-aG-G 的构建用凝胶回收试剂盒纯化回收目的基因片段，将目的基因片段与 pCMV-HA 载体分别经 EcoR和 Bgl限制性内切酶双酶切，回收酶切后的目的基因片段及载体片段，经 T4 DNA 连接酶于25 连接2 h，将连接产物转化至Trans1-T1 PhageResistant 化学感受态细胞，经氨苄青霉素抗性（50 g/mL）固体培养基选择培养，挑取阳性克隆16，构建重组质粒经双酶切初步验证，将初步鉴定正确的质粒送吉林省库美生物科技有限公司测序，将测序正确的重组质粒命名为pCMV-aG-G。1.2.4aG 株 G 蛋白的表达鉴定将 293T 细胞按细胞数 3105个/孔接种于 6孔板，37、5%CO2细胞培养箱培养，待细胞密度 达 到 70%90%后 开 始 转 染。将 pCMV-aG-G质粒利用 Hieff Trans脂质体核酸转染试剂转染至 293T 细胞，转染过程参照 Hieff Trans Liposomal Transfection Reagent 说明。转染 48 h 后，收集细胞，使用 RIPA 裂解液使细胞裂解，制备细胞裂解液蛋白样品。G 蛋白的表达鉴定采用 Westernblot 方法，将细胞裂解液蛋白进行还原性 SDS-PAGE 后，转印至硝酸纤维素膜 NC 膜，以 RV aG株 G 蛋白单抗为一抗、HRP 标记山羊抗小鼠 IgG为二抗进