克雷伯氏菌中群体淬灭基因k...6的克隆表达与酶学特性分析_刘栋.pdf

第 44 卷第 1 期 温 州 大 学 学 报（自 然 科 学 版）2023 年 2 月 Vol.44 No.1 Journal of Wenzhou University(Natural Science Edition)Feb.2023 克雷伯氏菌中群体淬灭基因 kplD6 的 克隆表达与酶学特性分析 刘 栋，赵一竹，杨惠婷，李亚茹，董新姣(温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)摘 要：群体淬灭酶是一类阻碍细菌间群体感应交流机制的重要物质，可以使信号分子降解或失活，从而阻止群体感应交流，进而破坏微生物多种行为和活动前期研究中发现 Klebsiella sp.Q2 是具有群体淬灭能力的细菌，对其进行基因组测序分析后，选取该菌株中一个预测具有群体淬灭功能的基因（命名为 kplD6）作为研究对象，进行基因克隆、异源表达、蛋白纯化、结构预测、活性检测和酶学特性分析结果表明，kplD6 基因全长 1 080 bp，编码蛋白质由 334 个氨基酸组成，相对分子质量 37 kDa，理论等电点为 5.25，是一种具有 TIM-barrel 结构的磷酸三酯酶类内酯酶，最适 pH 为 7，最适温度为45，Mn2+和 Co2+等金属离子可以显著增强该酶活性这对阐明 Q2 菌的群体淬灭功能的分子调控机制提供了更多信息 关键词：群体淬灭；克雷伯氏菌；kplD6；基因表达；磷酸三酯酶类内酯酶 中图分类号：Q936 文献标志码：A 文章编号：1674-3563(2023)01-0044-10 DOI：10.3875/j.issn.1674-3563.2023.01.006 本文的 PDF 文件可以从 https:/ 获得 群体感应（Quorum Sensing，QS）是一种细胞与细胞之间的交流过程1，使细菌能够获取周围环境中的菌体密度和菌种组成等信息，并据此调整自身的基因表达2群体淬灭（Quorum Quenching，QQ）是一种阻止群体感应过程的机制3，被认为是由发出 QS 信号的生物体为回收或清除自身的 QS 信号而进化的一种自然机制，或者是 QQ 菌在与发出 QS 信号的细菌在相互竞争的背景下进化而来的一种机制3这一作用可以阻止微生物形成生物膜，有效干扰这些微生物进行聚集性活动的能力群体淬灭作用主要表现在干扰信号分子合成、使信号分子失活或降解、阻止信号分子与受体蛋白结合、抑制其转录调节功能等方面4-7 目前已经发现或研制了一系列的群体感应抑制剂8-9、群体淬灭菌与群体淬灭酶10群体淬灭酶是从群体淬灭菌中发现的具有降解信号分子能力的酶类，由于发现或合成一种可以抑制大多数信号分子的抑制剂十分困难，因此对群体淬灭的研究热点转向了更加经济、环保、适应性更广的群体淬灭酶 群体淬灭酶能利用群体感应中的信号分子 N-酰基高丝氨酸内脂（Acyl Homoserine Lactone，AHL）作为底物，通过酶促反应使 AHL 分解11AHL 分子的酰基侧链长短不同，通常包含 4 至收稿日期：2022-02-22 基金项目：浙江省公益项目(LGF20E080022)作者简介：刘栋(1996)，男，山东省济宁市人，硕士研究生，研究方向：微生物 通讯作者，xjdong 刘栋等：克雷伯氏菌中群体淬灭基因 kplD6 的克隆表达与酶学特性分析 45 18 个碳原子，且在第三个碳原子的位置可以附加一个羰基或羟基的取代基，或者直接由芳香族酸代替侧链为方便识别，根据侧链长度和 C-3 原子的取代基不同产生不同的缩写形式比如 N-己酰基-L-高丝氨酸内酯缩写为 C6-HSL，N-3-羟基辛酰基-L-高丝氨酸内酯缩写为 OHC8-HSL，N-3-氧十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯缩写为 OC12-HSL 等 除此之外，信号分子也具有一些类似物，如一种廉价的食品添加剂-己内酯（-caprolactone，GCL），在结构上与 AHL 相似，可促进细菌的生长繁殖12现阶段发现群体淬灭酶的过程主要是先筛选出群体淬灭菌，再在 QQ 菌中寻找QQ 基因，目前已知的 QQ 基因有 aiiA13，attM14，ahlD15，hqiA16等，根据断裂信号分子的位置不同分为 AHL 内酯酶（AHL-lactonase）、脱羧酶（Decarboxylase）、酰基转移酶（Acylase）17、脱氨基酶（Deaminase）以及氧化还原酶等AHL 内酯酶大部分属于金属 内酰胺酶其他还有磷酸三酯类内酯酶（Phosphotriester-like，PLL），/水解酶折叠酶系，对氧磷酶（Paraoxonase）PON 家族，糖基水解酶家族等PLL 酶是一种金属依赖性蛋白，同时具有内酯酶活性和酰胺水解酶活性18-19 我们前期筛选出一株群体淬灭菌 Klebsiella sp.Q2，可以有效缓解生物膜污染20，基因测序并建库分析发现，kplD6 基因预测有群体淬灭活性本文以其作为实验对象，探究 kplD6 基因的克隆、表达与酶学特性，旨在为进一步揭示 Q2 的群体淬灭的调控机制提供参考 1 材料与方法 1.1 材 料 克雷伯氏菌 Klebsiella sp.Q2，大肠杆菌 Escherichia coli DH5，大肠杆菌 E.coli BL21（DE3），表达载体 pET28a 均由本实验室保存报告菌株紫色杆菌 Chromobacterium violaceum CV026，购自北京百欧博伟生物技术有限公司 1.2 Q2 菌株总 DNA 的提取 挑取 Q2 菌单菌落至 10 mL LB 培养基中，37，150 rpm 培养过夜，8 000 g 离心 2 min，弃上清，收集菌体，使用细菌基因组 DNA 快速抽提试剂盒（上海生工）提取 Q2 菌总 DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳，NanoDrop ND-2000 分光光度计检测 DNA 质量，-20保存 1.3 kplD6 基因的克隆 根据 Q2 菌基因组信息，设计 kplD6 基因特异性上游引物 kplD6-F：5-ATGGGTCGCGGATCC GAATTCATGAAAGGATCAATTTTTCGCC-3，酶切位点 EcoR；与下游引物 kplD6-R：5-CTC GAGTGCGGCCGCAAGCTTTTATCCGCCAAAGACCCGC-3，酶切位点 Hind 以 Q2 菌 DNA为模板，退火温度 55，体外扩增 kplD6 基因，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测产物使用 EcoR 与Hind 双酶切，对 pET28a 载体线性化，使用 Hieff Clone Plus Multi（翌圣生物）无缝克隆试剂盒将载体与目的基因连接，然后热激转化至 E.coli DH5 中，使用 T7 启动子引物，通过菌落 PCR筛选出阳性转化子，提取重组质粒进行双酶切验证，将验证正确的 pETkplD6 质粒委托上海赛音生物有限公司进行测序将测序正确的质粒转化至 E.coli BL21 中，再次进行菌落 PCR、双酶切、测序验证，得到 kplD6 异源表达菌 E.coli BL21-pETkplD6 1.4 KplD6 蛋白的表达纯化 挑取 1.3 中构建的异源表达菌 E.coli BL21-pETkplD6 至 LB 中，37C，200 rpm 培养至OD600=0.6 时，取 1/100 菌液至新 LB 中，37C，200 rpm 培养至 OD600=0.6 时，将 BL21-pETkplD6 温州大学学报（自然科学版）(2023)第 44 卷第 1 期 46 分为两组，一组不经 IPTG 诱导，另一组经 IPTG 诱导，加入 IPTG 至终浓度 0.5 mg/mL，18C，200 rpm，培养 16 h诱导后的 KplD6 蛋白会带有 His-tag 标签，可以使用镍离子纯化柱通过亲和层析的方法纯化，以获得 KplD6 纯蛋白SDS-PAGE 电泳检测后，将蛋白溶液通过超滤柱进行浓缩与置换缓冲液 1.5 生物传感器对信号分子的检测和群体淬灭活性检测 使用 C.violaceum CV026 作为生物传感器21，将 CV026 单菌落接种至 LB 培养基中，30C 150 rpm，培养至 OD600=1.0取 20 mL 固体 LB，加热融化并冷却至 50 C，取 1 mL CV026 菌液加入并倒平板，凝固后使用 7 mm 打孔器打孔将待测液体上样 40 L 至平板孔中，30 培养 16 h后观察平板上孔周围的显色圈大小并量取直径22 将目的蛋白与 10 mol/L C6-HSL 混合，30水浴 3 h，进行信号分子的降解反应 将 10 mol/L C6-HSL 30水浴 3 h 作为阳性对照，将 H2O 作为阴性对照，使用报告菌株 CV026 检测目的蛋白的淬灭活性 标准曲线的建立分别取浓度为 0 mol/L、0.5 mol/L、1.0 mol/L、2.0 mol/L、3.0 mol/L、4.0 mol/L、5.0 mol/L、7.5 mol/L 和 10.0 mol/L 的信号分子 C6-HSL 作为待测液体上样至同一个平板中，量取显色圈直径并建立标准曲线标准曲线为 y=0.075 6e0.979 7x，其中，y 表示相对活性，x 表示显色圈直径相关系数 R2=0.992 7 1.6 蛋白的理化性质分析 使用 Expasy（https:/web.expasy.org）23分析蛋白质的理化性质，如：等电点、分子质量、氨基酸组成、消光系数、稳定系数、亲疏水性等使用 SignalP-6.0（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP）24预测蛋白 KplD6 的 N 端信号肽使用 prabi（https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测蛋白的二级结构利用 BLAST（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对工具，对 KplD6 进行氨基酸序列比对分析，并获取关联性淬灭酶使用 PBD（https:/www.rcsb.org/）数据库获取其他淬灭酶蛋白的氨基酸序列使用软件MEGA X（version 10.2.6）25进行多重氨基酸序列比对并构建系统发育进化树 1.7 酶学特性检测 1.7.1 最适 pH 分别在 pH 为 6.0、7.0 和 8.0 时检测 KplD6 蛋白酶的降解能力 首先使用 Tris-HCl 缓冲液（pH 6.0）、磷酸钠缓冲液（pH 8.0）置换 PBS 缓冲液使蛋白酶处于 pH 6.0 和 pH 8.0 的环境中随后取pH 为 6.0、7.0、8.0 时的蛋白 12 g 与终浓度 10 mol/L 的 C6-HSL 混合在 200 L 各 pH 的缓冲液中，30 水浴 2 h,在 95 加热 3 分钟终止反应，使用生物传感器检测蛋白酶的最适 pH 1.7.2 最适温度 将纯化后的蛋白 KplD6 12 g 与终浓度 10 mol/L 的 C6-HSL 混合在 200 L 缓冲液（pH 7.0）中，混合液分别于 4、10、15、20、25、30、35、40和 45反应 2 h，95加热 3 分钟终止反应，使用生物传感器检测蛋白酶的最适温度，检测结果使用软件 GraphPad Prism 8 进行统计并绘图 1.7.3 不同金属离子与 GCL 对蛋白活性的影响 配置 1 mol/L 的 Ni+、Mn2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Co2+、Ba2+和 GCL 母液，将纯化后的蛋白 KplD6 12 g 与终浓度 10 mol/L 的 C6-HSL 混合在 200 L 缓冲液（pH 7.0）中，并在混合液 刘栋等：克雷伯氏菌中群体淬灭基因 kplD6 的克隆表达与酶学特性分析 47 中加入各金属离子与 GCL 至终浓度 1 mol/L、10 mol/L、100 mol/L 和 1 mmol/L，混合液在 30 浴 2