3-O-乙酰转移酶的表达及其酶活特性研究_谭剑.pdf

第52卷第2期 当 代 化 工 Vol.52，No.2 2023年2月 Contemporary Chemical Industry February，2023 基金项目基金项目：国家重点研发计划（项目编号：NO.2019YFE0197300）。收稿日期收稿日期：2022-10-31 作者简介作者简介：谭剑（1991-），男，北京市人，高级工程师，硕士，2015 年毕业于上海交通大学生物工程专业，研究方向：食品安全与菌株开发。E-mail：。通通信信作者作者：李义（1964-），男，正高级工程师，硕士，研究方向：玉米深加工技术。E-mail：li-。3-O-乙酰转移酶的表达及其酶活特性研究 谭剑1,3,4，隋淼2，李凡1,3,4，李义2（1.中粮营养健康研究院，国家能源生物液体燃料研发中心，北京 102209；2.吉林中粮生化有限公司，玉米深加工国家工程研究中心，吉林 长春 130033；3.营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京 102209；4.老年营养食品研究北京市工程实验室，北京 102209）摘 要：将 3 个不同来源的 3-O-乙酰转移酶基因转入大肠杆菌表达宿主，成功实现 3 种 3-O-乙酰转移酶的异源表达，并通过诱导条件优化提高了可溶蛋白表达量。酶活特性研究结果显示，3 种不同来源的乙酰转移酶在不同温度及 pH 条件下活性有着显著差异，其中 Fo1TRI201 最适温度及 pH 分别为 40 及 pH=5.0，有着更强的温度及pH耐受性。最后在工业物料中考察了粗酶液的脱毒效果，通过向玉米浸泡液中添加1%的Fo1TRI201粗酶液，在 40、pH=5.0 条件下 24 h 可将玉米浸泡液中的 DON 从 2 000 gL-1以上降解至 500 gL-1 以下，降解率最高达 82.64%，为呕吐毒素脱毒产品和技术开发提供了选择和参考，具有一定的商业应用价值。关 键 词：3-O-乙酰转移酶；呕吐毒素；酶活特性；工业物料 中图分类号：Q555 文献标识码：A 文章编号：1671-0460（2023）02-0473-05 Expression and Characterization of 3-O-Acetyltransferase TAN Jian1,3,4,SUI Miao2,LI Fan 1,3,4,LI Yi2(1.COFCO Nutrition and Health Institute,National Energy R&D Center for Liquid Biofuels,Beijing 102209,China;2.National Engineering Research Center of Corn Deep Processing,Changchun Jilin 130033,China;3.Beijing Key Laboratory of Nutrition Health and Food Safety,Beijing 102209,China;4.Beijing Engineering Laboratory for Geriatric Nutrition Food Research,Beijing 102209,China)Abstract:Three 3-O-acetyltransferase genes from different strains were transferred into the expression host of E.coli,and were successfully expressed.The expression of soluble proteins was improved by optimizing the induction conditions.The enzyme characteristics study showed that the activity of acetyltransferase from three different strains was significantly different under different temperature and pH conditions,among which the optimum temperature and pH of Fo1TRI201 were 40 and pH=5.0,respectively,with stronger temperature and pH tolerance.Finally,the detoxification effect of the crude enzyme solution was investigated in industrial materials.By adding 1%Fo1TRI201 crude enzyme solution to the corn soaking solution,the DON in the corn soaking solution was degraded from more than 2 000 gL-1 to less than 500 gL-1 under the condition of 40 and pH=5.0 in 24 h,with the highest degradation rate of 82.64%.Our study provides a choice and reference for the development of detoxification products and technologies for DON,and has certain commercial application value.Key words:3-O-Acetyltransferase;Deoxynivalenol;Enzyme activity;Industrial materials 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）,化学名 3,7,15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，为一种主要由禾谷镰刀菌、粉红镰刀菌、尖孢镰刀菌和雪腐镰刀菌等镰刀菌属产生的一种单端孢霉烯族化合物，因其可以引起猪的呕吐又被称为呕吐毒素1-2。作为全球范围内粮食、饲料和食品的主要污染霉菌毒素之一，呕吐毒素对人和畜禽的健康造成严重影响，呕吐毒素超标也成为目前粮食、饲料加工相关产品的主要问题3。目前，国内外针对呕吐毒素的脱毒方法主要分为物理法、化学法和生物法三大类4。物理和化学法因脱除效果有限、可能造成营养物质损失、二次污染等缺点，从而限制了其在生产中的应用5-6。生物法脱毒利用微生物或酶进行毒素降解，由于其温和、高效且具有较强特异性，受到越来越多的关 注7-8。利用现代生物技术去除粮食加工副产物及饲料原料中的呕吐毒素研究具有良好的应用前景，但应用于粮食加工过程中存在较高温度负荷或苛刻的酸碱条件下效率显著降低的问题。研究表明，在 DON 的合成过程中，C3 位羟基生物化工 DOI:10.13840/21-1457/tq.2023.02.027 474 当 代 化 工 2023年2月 的乙酰化形式可以作为中间产物抑制 DON 的合 成9，从而保护作物抵制 DON 的毒害10，因此 DON乙酰化酶已经被应用在植物抗病育种中，乙酰化酶类也是目前研究和报道最多的对呕吐毒素具有降解作用的酶11-14。3-O-乙酰转移酶存在于多种镰刀菌属，编码基因为 TRI101/TRI201，可将呕吐毒素的3-OH 进行修饰进而转化为 3ADON。不同来源的TRI101/TRI201 基因在序列相似性达到 66%98%，降解 DON 效果为 50.5%100%15。在针对酿酒酵母基因改造降低发酵产物 DDGS 中呕吐毒素的研究中，两个来源的基因（FgTRI101、FfTRI201）被证明具有比较好的效果16。SCHMALE 等进一步对 33种不同来源的 TRI101/TRI201 基因进行构建和体外表达17，详细比较分析了各种来源的乙酰转移酶的表达量、脱毒效果等。本研究通过文献调研及GenBank数据库而分析比对，选择 3 个不同来源的 3-O-乙酰转移酶Ff1TRI201、Fcr2TRI101、Fo1TRI201 进行研究，通过基因合成、表达质粒和表达菌株构建实现 3 种酶在大肠杆菌宿主中的成功表达，并通过不同温度、pH 条件下酶活特性研究确定其最适反应条件，最终筛选酶活性较高、温度及 pH 耐受性较强的 3-O-乙酰转移酶进行工业物料中 DON 降解评价，为后续DON 脱毒酶开发及粮食加工过程中 DON 的脱除提供基础。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 基因、载体和菌株 Ff1TRI201、Fcr2TRI101、Fo1TRI201 基因序列由生工生物工程（上海）股份有限公司进行全基因合成；表达载体 pET30a、表达宿主 Transetta(DE3)感受态细胞，全式金生物技术有限公司。1.1.2 培养基 LB 固体培养基：胰蛋白胨 10 gL-1，酵母提取物 5 gL-1，NaCl 10 gL-1，琼脂 15 gL-1，pH=7.0，121 高压灭菌 20 min。LB 液体培养基：成分除无琼脂外同 LB 固体培养基，60 mL 装于 250 mL 三角瓶，121 高压灭菌20 min。1.1.3 主要试剂和仪器 呕吐毒素（DON）标准品，美国 Sigma 公司；DONStarR 免疫亲和净化柱，Romer 公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶及 PCR 反应体系所需试剂，Takara 公司；色谱级乙腈、甲醇，ThermoFisher；其他实验常规试剂。凝胶成像系统，美国 UVP；蛋白电泳仪，Invitrogen 公司；高效液相色谱仪 1260，Agilent；PCR仪，Bio-Rad；恒温摇床，Thermofisher；低温离心机，Eppendorf；高压蒸汽灭菌锅，日本 TOMY；分子杂交箱，韩国 Finepcr；超净工作台。1.2 方法 1.2.1 重组表达载体与菌株的构建 Ff1TRI201、Fcr2TRI101、Fo1TRI201 基因序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，载体pET30a 由全式金公司提供，分别经 BamHI 和 NotI双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳切胶回收；T4 DNA 连接酶将酶切后的载体 pET30a 和 Ff1TRI201、Fcr2TRI101、Fo1TRI201 片段连接，转化大肠杆菌DH5。经含有 50 gmL-1卡那霉素（Kanamycin，Kan）的 LB 平板筛选，37 过夜培养，挑取单菌落送华大基因测序，证明连接成功。提 取 重 组 表 达 载 体 pET30a-Ff1TRI201、pET30a-Fcr2TRI101、pET30a-Fo1TRI201，电击转化表达宿主 Transetta（DE3）感受态细胞，涂布含有50 gmL-1卡那霉素和 20 gmL-1 氯霉素抗性平板进行筛选，37 过夜培养。随机挑取抗性平板上的单菌落进行菌落 PCR 验证，PCR 反应体系（50 L）：PrimeSTAR max 25 L，模板 1 L，T7 正、反引物各 1 L，补水至 50 L。PCR 反应条件参考聚合酶说明书设置。PCR 扩增产物经凝胶电泳检测及测序比对，证明重组表达载体成功转化 Transetta（DE3）感受态细胞，重组表达菌株构建成功。1.2.2 重组菌株的诱导表达 重组菌株菌液涂布含有卡那霉素（Kan）及氯霉素（Cm）的抗性 LB 平板培养基上，37 培养过夜后挑取单菌落接种于5 mL含有50 gmL-1卡那霉素和 20 gmL-1氯霉素的 LB 试管培养基中，37、220 rmin-1培养过夜，以初始 OD=0.01 转接至含有30 mL 相同抗性 LB 培养基的三角瓶中，37、220 rmin-1培养菌体 OD600 至 0.61.0 时，降温至25 并加入