CRISPR_Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展_滕小龙.pdf

2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023，4（1）：67-85CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展滕小龙，史硕博（北京化工大学，北京软物质科学与工程高精尖创新中心，北京 100029）摘要：CRISPR/Cas9是近年来发展起来的新兴技术，其在多种生物和组织的基因组上具有快速、高效、精准的基因编辑与调控能力，这使得该技术在基础科学和合成生物学等应用科学领域均得到了极大的发展与应用。本文首先对CRISPR的历史沿革、分类及CRISPR/Cas9技术的作用机制进行简述，并结合其原理和在基因组工程中面临的脱靶率高、PAM依赖性强等限制因素总结了近年来针对Cas9蛋白和向导RNA（gRNA）进行的一系列优化与改造。接下来详细叙述了CRISPR/Cas9系统结合效应蛋白实现的多种功能，包括基因表达调控、表观基因组编辑、单碱基编辑等。基于gRNA多表达策略和Cas9多路复用策略，本文还对CRISPR/Cas9技术主要的多重应用成果进行了梳理汇总。最后探讨了CRISPR/Cas9作为高精度基因组编辑工具使用的应用前景，以及作为疗法使用时的安全性和风险控制问题。关键词：CRISPR/Cas9；基因组编辑；表达调控；多重编辑；效应蛋白中图分类号：Q819 文献标志码：A Optimization and development of CRISPR/Cas9 systems for genome editingTENG Xiaolong，SHI Shuobo（Beijing Advanced Innovation Center of Soft Matter Science and Engineering，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China）Abstract:As an emerging technology developed within recent years,CRISPR/Cas9 exhibits fast,efficient,and precise gene editing and regulation capabilities in various organisms and tissues,and these advantages make it widely used in research with fundamental sciences and applied technologies as well such as synthetic biology.This review first briefly introduces the discovery history,classification,and mechanism of CRISPR/Cas9.The system of CRISPR/Cas9 usually contains a single guide RNA(gRNA)molecule for targeting a specific sequence,and a Cas9 endonuclease for catalyzing a double-strand break(DSB)in the sequence(target DNA strands).The recognition and cleavage of target DNA strictly require the presence of a protospacer adjacent motif(PAM)in the target sequence.The DSB(s)can be repaired by various DNA repair mechanisms,which allow various gene editing such as gene integration,gene 收稿日期：2022-09-01 修回日期：2022-10-28基金项目：国家自然科学基金（21878013）引用本文：滕小龙，史硕博.CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展 J.合成生物学，2023，4（1）：67-85Citation：TENG Xiaolong，SHI Shuobo.Optimization and development of CRISPR/Cas9 systems for genome editing J.Synthetic Biology Journal，2023，4（1）：67-85DOI:10.12211/2096-8280.2022-047特约评述合成生物学 第 4 卷replacement,and gene knockout.Due to limitations of CRISPR/Cas9,such as PAM dependence and high off-target rate,researchers have developed various fused or engineered Cas9 proteins and gRNAs that play significant roles in fulfilling various purposes.These Cas9 variants are modified for improving the performance of PAM,in particular its specificity and fidelity.Moreover,the DSBs generated by Cas9 are considered toxic to the cells,and the use of Cas9 nickase(nCas9)or catalytically deficient Cas9(dCas9)in CRISPR has also been developed without generating DSBs.Meanwhile,different effector proteins can be fused with Cas9/dCas9/nCas9 to bring about new functions and applications in gene expression regulation,epigenome editing,and single base editing.Moreover,we introduce the current studies and applications of multiple gRNA expression strategies based on the multiplex advantages of the CRISPR/Cas9 system.In general,CRISPR/Cas9 systems have gradually become standardized and revolutionized genome editing systems for almost all possible genetic manipulations.Finally,we highlight perspectives on several applications of the versatile CRISPR/Cas9 toolbox as a genome editing tool,and discuss the safety and risk control issues when it is used in gene therapy.Keywords:CRISPR/Cas9;genome editing;expression regulation;multiplexed genome editing;effector protein对遗传信息进行编辑和对基因表达进行调控是研究各种遗传信息的具体功能、揭示基因独特生理机制的重要方法。进入新世纪后，来源于原核生物的簇状规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR 相 关 蛋 白（CRISPR-associated protein，Cas protein）系统蓬勃发展，成为应用于基因组工程中的重要技术。早在1987年，研究人员就在大肠杆菌基因组上发现了这一段特殊的序列1。2002年，Jansen等2通过大量观察创造了CRISPR068第 4 卷 缩写代替了之前发现的重复片段。随后，Brouns等3揭示了该系统对DNA的靶向作用及原理，从而推测出该系统具有作为基因编辑工具的潜力。2013年，张锋团队4首次实现CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中的多基因编辑，开启了基因编辑技术的新篇章。依据 Cas蛋白的结构和进化关系，目前 CRISPR/Cas 系统共分六种类型，其中、型系统的Cas蛋白为多亚基，、型系统的 Cas 蛋白为单亚基5-6。由于单亚基CRISPR/Cas系统机制简单且易操作，目前研究成熟和应用广泛的大多为单亚基系统，如型的CRISPR/Cas9系统、型的CRISPR/Cas12a（Cpf1）系统和型的CRISPR/Cas13a（C2c2）系统等。其中CRISPR/Cas9系统凭借其操作简便、精准编辑、多重编辑等优势，与传统的DNA修饰工具如大范围核酸酶（meganucleases，MGNs）7、锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）8、转录激活因子样效应蛋白核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）9等区分开来，使其在基础科学到应用科学领域均得到了极大的发展与应用。CRISPR系统利用单链向导RNA（single guide RNA，sgRNA 或 gRNA）靶向目的位点，随后Cas9等核酸酶切断目的区域的双链核酸，诱导细胞内源DNA损伤修复机制工作，最终借助该机制达到编辑遗传信息的目的10。CRISPR/Cas9系统在发挥基因敲除、基因插入、单碱基编辑等主要编辑手段时主要依靠的是细胞内源的非同源末端连接修复机制（non-homologous end joining，NHEJ）、微同源介导末端连接机制（microhomology-mediated end joining，MMEJ）或 同 源 重 组 修 复 机 制（homology directed repair，HDR）11。NHEJ 系统进行双链断裂（double-strand breaks，DSBs）修复时，首先 Ku 异源二聚体识别并结合至两断裂末端，随后由DNA聚合酶和核酸外切酶对该处进行加工处理，最后进行末端连接形成双链。在对末端进行修饰时，由于外切酶和聚合酶结合顺序的不确定性则造成修复位点碱基缺失和插入突变等不同情况，致使目的基因失去活性12。也有报道将 Cas9 蛋白靶向目的基因或染色体上两处位点，则会造成目的基因内或染色体上整段序列的缺失4，13-15。MMEJ在修复双链断裂时的断裂末端比对过程中使用的微同源序列易导致原始断裂侧翼缺失，进而造成染色体异常如缺失、易位、倒位和其他复杂的重排。Cas9蛋白造成DNA双链断裂后，在损伤序列的同源供体DNA如姐妹染色单体存在的情况下，HDR则以同源DNA序列为模板进行无错修复。若人为地提供一段含有外源基因或替换了特定位置核苷酸的同源供体DNA（donor），则可利用HDR实现精准的基因插入或单碱基编辑（图1）16。随着CRISPR/Cas9技术的普及和发展，其基本的基因编辑能力和性能已不能满足在基因组工程和各个领域中的应用。例如