BBR联合ADSCs移植对...疗作用与保护胰岛的机制研究_田晋明.pdf

基金项目：辽宁省教育厅自然科学基金委员会重点项目，项目编号：。作者简介：田晋明（），男，重庆人，在读硕士研究生，主要研究方向为干细胞与糖尿病的治疗。通讯作者：杨静娴（），女，辽宁大连人，教授，博士学位，主要研究方向为干细胞与组织再生技术。联合 移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究田晋明，赵宇萌，李贺，田雨，杨静娴（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连）摘要：目的 探究黄连素（，）联合脂肪间充质干细胞（，）对糖尿病（，）小鼠的治疗效果以及对胰岛细胞的保护作用与机制。方法通过一次性腹腔注射链脲佐菌素（）建立 小鼠模型。将成模的小鼠随机分为模型组、组、组、联合组（联合），另取正常小鼠做对照组，每组 只，相应治疗 。观察血糖和糖耐量的变化，并计算糖耐量曲线下面积（，）；酶联免疫吸附实验（，）检测小鼠血清内肿瘤坏死因子（，）、干扰素（，）的水平；苏木精伊红（，）染色检测小鼠胰岛的病理损伤情况；免疫荧光法检测小鼠胰岛 细胞凋亡；免疫组化以及 法检测小鼠胰腺组织 样受体 （，）、髓样分化初反应蛋白 （，）、核因子 （，）、蛋白与 的表达。结果与模型组、组或 组比较，联合组小鼠血糖及糖耐量降低，血清、含量减少，胰岛病理损伤减轻，细胞凋亡数减少，胰腺组织、蛋白与 的表达降低。结论 与 移植联合治疗可通过抑制 信号通路减轻 小鼠机体炎症反应与胰岛的病理损伤，对 小鼠有一定治疗作用，且其效果好于单用 或 治疗。关键词：脂肪间充质干细胞；糖尿病；黄连素；胰岛中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：（）（）（）（），（），（）；（）（）（）；（）；，锦州医科大学学报 （）DOI:10.13847/ki.lnmu.2023.01.022 ：；糖尿病（）是一种以高血糖为主要症状的免疫和代谢性疾病，常见类型为 型糖尿病（，）、型糖尿病（，）。胰岛细胞的自身免疫性炎症是两种类型 的重要病理生理机制之一，胰岛的长期炎症诱导胰岛 细胞损伤，将加重 的进程。样受体 （），髓样分化初反应蛋白 （）、核因子 （）是经典的促炎通路，多项研究表明，在 的发生发展过程中，该通路中的相关蛋白表达增加，在体内 和配体结合能引起、的级联反应，从而促使炎症因子表达与释放，引起并加重胰岛 细胞损伤。间 充 质 干 细 胞（，）有强大的免疫调节功能，其能通过旁分泌免疫调节因子起到减轻炎症，促进组织修复的作用，有从根源治疗 的潜力。但多项研究表明，输注治疗 的疗效受患者体内的高血糖、炎症等不良微环境影响。因此改善 患者体内的不良微环境是提高 移植治疗效果的有效途径。黄连素（）产自于黄连，是黄连发挥降血糖效果的主要药效成分，同样能减少 患者机体炎症因子与终末糖基化产物的生成，改善胰岛素抵抗和内质网应激，具有抗氧化、降血糖、保护胰岛 细胞的作用。此外已有研究报道 有促进 分泌营养因子、抑制 凋亡的效果，对 存活有积极作用。我们推测将 与 联合使用可能会提高 对 的治疗效果。因此本研究采用 联合 移植治疗，通过对 小鼠的血糖、糖耐量检测，观察两者联用对 的治疗效果，利用、病理染色、等方法探讨联合治疗对 小鼠胰岛细胞的保护作用及可能机制，阐明 对 的增效作用。材 料 实验动物 级昆明种雄性小鼠，体质量（），购自辽宁长生生物科技有限公司；许可证号：（）。饲养于指定的动物护理室，温度：（）；湿度：（），自由饮食饮水。小鼠适应性饲养 后用于实验。本研究经辽宁中医药大学动物伦理委员会批准后进行，许可证号：（）。主要试剂小鼠脂肪间充质干细胞（）（赛业生物科技有限公司，批号：），链脲佐菌素（，）（北京索莱宝科技有限公司，批号：），培养基（，批号：），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：），盐酸小檗碱（）（上海麦克林生化科技有限公司，批号：），、酶联免疫试剂盒（上海 科 兴 生 物 科 技 有 限 公 司，批 号 分 别 为：、），染色试剂盒，一抗（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为：、），、兔抗小鼠一抗，标记的抗兔、标记的兔抗小鼠二抗（沈阳 万 类 生 物 技 术 有 限 公 司，批 号 分 别 为：、），羊抗兔（）二抗、显色试剂盒（北京索莱宝生物技术有限 公 司，批 号 分 别 为：，），（公司，批号：），合成试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：），（上海碧云天生物技术有限公司，批号：）。主要仪器培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司，中国，型号 型），恒温冷冻切片机（赛 默 飞 世 尔 科 技 有 限 公 司，美 国，型 号：型），荧光显微镜（尼康公司，日本，型号：型），血糖仪（三诺生物传感股份有限公司，型号：型），酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：型），实时定量 仪（美国 公司，型号：型）。方 法 造模、分组与给药小鼠适应性喂养 后。禁食不禁水 ，一次性腹腔注射 （）溶液构建 模锦州医科大学学报 年 月，（）型，造模 后恢复进食。于造模后第、第 天行剪尾采血检测血糖。连续两次随机血糖 ，确定为 模型。将成模的 只 小鼠随机分为模型组、组、组、联合组，每组 只，另取 只正常小鼠作为对照组。自成模日开始，组以及联合组，灌胃给予 的，每日 次，连续 ，对照组、模型组、组分别灌胃给予等体积生理盐水；初次灌胃给药次日，组、联合组尾静脉注射 总量为 个小鼠 悬液，对照组、模型组、组小鼠尾静脉注射等量的。小鼠的血糖和糖耐量检测从给予 当天开始，测定给药后第、第、第、第 天小鼠随机血糖，于第 天禁食 后进行空腹糖耐量测试，即灌胃给予小鼠葡萄糖 ，测量、血糖值，并计算曲线下面积（，）。法检测 小鼠血清炎症因子的含量实验结束后对小鼠行眼眶取血，离心 获取血清，采用 试剂盒测定血清 和 的含量，具体操作步骤依照试剂盒说明书进行。小鼠胰腺组织切片病理学分析采血后处死小鼠，取出胰腺组织，多聚甲醛固定，蔗糖脱水，包埋，进行冰冻切片。染色，观察小鼠胰腺组织病理损伤情况；免疫荧光（抗 和抗 ）染色，复染，计算 面积与 细胞数；免疫组织化学（抗、）染色，苏木素复染，计算胰岛平均光密度值（胰岛的光密度值累加起来得到的 值与胰岛的面积 的比值）。以上实验分别保持相同条件拍照，所得图片采用 软件分析。实时荧光 检测小鼠胰腺组织、的表达给药结束后，收集各组小鼠胰腺组织，加入 试剂提取总，检测完 浓度和完整性后按试剂盒说明逆转录成，反应条件为：，个循环。内参基因选用，使用 法计算基因的相对表达量，见表。表 引物序列基因名上游引物序列（）下游引物序列（）统计学方法实验数据以表示，结果采用 软件进行统计分析，血糖、糖耐量数据多组间不同时间点比较采用重复测量双因素方差分析（）结合 检验，其他数据多组间比较采用单因素方差分析（），以 为差异具有统计学意义。结 果 小鼠血糖给予 联合 治疗后，于第、第、第、第 天检测小鼠随机血糖，结果发现，随着病程延长，模型组小鼠血糖持续升高，与对照组比较有显著差异（）；与模型组比较，组、组、联合组小鼠血糖明显降低（），其中 组、组小鼠血糖在第 天后又逐渐回升；而联合组小鼠血糖持续下降，与 组或 组比较有显著差异（），见表。提示 联合 治疗能降低 小鼠血糖，提高 的降血糖效果。小鼠糖耐量经过治疗后，对小鼠进行空腹糖耐量测试。结果显示，模型组小鼠在灌胃葡萄糖溶液 后的血糖及 较对照组明显升高（）；经治疗后，与模型组比较，组、组、联合组小鼠在灌胃葡萄糖溶液 后的血糖及 均出现明显下降（或 ）；其中联合组小鼠灌胃葡萄糖溶液 后的血糖及 降低更显田晋明，等：联合 移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究著，后血糖接近测试前水平，与 组或 组比较有显著性差异（或 ），见表。提示 联合 治疗能增强 改善 小鼠糖耐量的能力。表 联合治疗对 小鼠血糖的影响（，）组别血糖浓度（）初始第 天第 天第 天第 天对照组 模型组 组 组 联合组 注：与对照组比较，；与模型组比较，；与 比较，；与 组比较，表 联合治疗对 小鼠糖耐量的影响（，）组别血糖浓度（）曲线下面积（）对照组 模型组 组 组 联合组 注：与对照组比较，；与模型组比较，；与 组比较，；与 组比较，小鼠血清炎症因子治疗结束后，通过 实验检测 小鼠血清 与 含量发现，与对照组比较，模型组小鼠血清 与 含量明显上升（）；而与模型组比较，组、组、联合组小鼠血清 与 含量明显降低（）；其中联合组小鼠血清 与 含量降低更突出，与 组或 组比较有显著性差异（），见表。提示 联合 治疗能减少 小鼠机体炎症因子的产生，增强 的免疫调节能力。小鼠胰岛病理损伤 染色结果发现，对照组胰岛结构正常，边缘清晰，为圆形细胞团，胰岛内细胞数量较多、排列整齐，胞浆、胞核染色正常；与对照组比较，模型组胰岛边缘模糊不清，普遍萎缩，胰岛内细胞数目减少、排列紊乱，细胞核深染，固缩，胰岛细胞空泡化，且可见明显的炎症细胞浸润；而与模型组比较，组、组、联合组胰岛结构基本正常，边缘清晰，胰岛内细胞数目增多、排列整齐，细胞核、细胞质染色均匀，炎症细胞浸润减少，且联合组小鼠胰岛以上病理损伤现象改善尤其明显，见图。以上结果表明，联合 治疗能减轻 小鼠胰岛的病理损伤。表 联合治疗对 小鼠血清炎症因子的影响（，）组别（）（）对照组 模型组 组 组 联合组 注：与对照组比较，；与模型组比较，；与 组比较，；与 组比较，小鼠胰岛 细胞的凋亡 是主要的细胞凋亡执行者，表达的升高意味着细胞逐渐趋于凋亡，由胰岛 细胞分泌，因此我们利用免疫荧光、染色代表凋亡的胰岛 细胞。结果见图、图，与对照组比较，模型组小鼠胰岛内 面积明显减少（），细胞凋亡数目增多（）；治疗后，与模型组比较，组、组、联合组小鼠胰岛内 面积增多（或 ），凋亡细胞数目减少（或 ）；且与 组或 组比较，联合组小鼠更显著（或 ）。提示锦州医科大学学报 年 月，（）联合 治疗能有效减少 小鼠胰岛 细胞凋亡。图 各组小鼠胰岛的病理损伤改变（染色，）图 各组小鼠胰岛 细胞的凋亡情况（免疫荧光，）与对照组比较，；与模型组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 各组小鼠胰岛内 面积（）与 细胞数统计（）小鼠胰岛、蛋白的表达免疫组化结果见图、图，与对照组比较，模型组小鼠胰岛、蛋白的表达明显上升（）；而与模型组比较，组、组、联合组小鼠胰岛、蛋白的表达明显降低（或 ）；其中联合组小鼠降低更明显。表明 联合 治疗能通过抑制 通路相关蛋白及下游炎症因子表达保护胰岛细胞。田晋明，等：联合 移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究图 各组小鼠胰岛、蛋白的表达（免疫组化，）与对照组比较，；与模型组比较，；与 组比较，图 各组小鼠胰岛、平均光密度锦州医科大学学报 年 月，（）小鼠胰腺组织、的表达 小鼠腺组织的 结果见图，与对照组比较，模型组小鼠胰腺组织、表达明显增加（）；治疗后，与模型组比较，组、组、联合组小鼠胰腺组织、表达明显降低（或 ），其中联合组小鼠降低更明显，提 示 联 合 能 通 过 抑 制、表达减少 的胰岛损伤。与对照组比较，；与模型组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 各组小鼠胰岛、表达 讨 论 是一种典型的 模型诱导剂，注射 后可引起 细胞内辅酶 （，）的浓度下降，依赖性能量和蛋白质代谢停止，同时诱导一氧化氮（）的合成，导致 细胞死亡，从而引起高血糖，造成机体代谢紊乱。本研究结果发现注射 后，与对照组比较模型组小鼠血糖持续升高，糖耐量受损，胰岛出现病理损伤，细胞凋亡增加，表明本研究采用 构建了可靠的小鼠 模型。与大多数 一样，有治疗 的潜力，但 患者体内微环境的复杂性同样也导致了其疗效的不稳定。目前，增加 移植次数、对 进行基因修饰、与药物联合等方式是研究者们试图增强 移植治疗效果的常用手段。多次注射 能在一定程度上增加其在患者体内发挥治疗作用的有效细胞数量，但也有栓塞的风险，而这是细胞治疗导致患者死亡的原因之一。基因修饰则通过对 过表达负责生存、迁移和免疫调节等特性基因，从而使 的治疗更有针对性，但慢病毒转染后的 的生物安全性与致瘤致畸作用一直是学术界担心的问题。因此运用基因修饰和多次注射的方法提高 治疗效果的实用性还有待考