1株耐酸秸秆纤维素降解菌株...内切葡聚糖酶的异源表达研究_张超.pdf

试验研究NO.02 202389饲料研究 FEED RESEARCH1株耐酸秸秆纤维素降解菌株的筛选、鉴定及其内切葡聚糖酶的异源表达研究张超1，2 李晓意1 杨吉1 武晓乐1 张洋3 李孟欣1 刘宇欣1 李凯悦1（1.衡水学院生命科学学院，河北 衡水 053000；2.河北省果蔬发酵技术创新中心，河北 衡水 053000；3.河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071001）摘要：试验旨在解决农作物秸秆饲料化过程中，秸秆纤维素难降解、适口性差和营养价值低等问题。试验以玉米秸秆粉为唯一碳源，从堆砌秸秆的土壤中分离筛选出1株耐酸且具有高纤维素酶活性的菌株HSU-20SJ。经3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性，利用形态学、生理生化和16S rDNA进行种属鉴定，通过分子克隆技术，构建内切葡聚糖酶的大肠杆菌异源表达系统。结果显示，菌株HSU-20SJ粗酶液酶活为3.23 U/mL，最适反应pH值为5.0。该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），从菌株HSU-20SJ基因组中获得内切葡聚糖酶基因eg20SJ，异源表达后获得重组酶，分子量约为55 kDa，粗酶液酶活为6.28 U/mL。研究表明，试验在获得耐酸、高纤维素酶活菌株基础上，实现了内切葡聚糖酶基因的异源表达，可为纤维素酶的规模化生产和应用提供参考。关键词：秸秆；纤维素；降解；内切葡聚糖酶；异源表达中图分类号：S 816.7 文献标识码：A 文章编号：1002-2813（2023）02-0089-05 Doi：10.13557/ki.issn1002-2813.2023.02.018Study on screening and identification of an acid-tolerant straw cellulose-degrading bacteria and heterologous expression of endoglucanaseZHANG Chao LI Xiao-yi YANG Ji WU Xiao-le ZHANG Yang LI Meng-xin LIU Yu-xin LI Kai-yueAbstract:The study was to solve the problems of straw cellulose difficult to degrade,poor palatability and low nutritional value in process of straw feed.Used corn stalk powder as sole carbon source,a strain HSU-20SJ with high cellulase activity and acid-tolerance was isolated from soil piled with straw.Cellulase activity was determined by 3,5-dinitrosalicylic acid method,species identification was carried out by morphology,physiology and biochemistry and 16S rDNA,and the heterologous expression system of endoglucanase in Escherichia coli was constructed by molecular cloning technology.The results showed that the crude enzyme activity of strain HSU-20SJ was 3.23 U/mL,and the optimum reaction pH was 5.0.The strain was identified as Bacillus velezensis.The endoglucanase gene eg20SJ was obtained from its genome,and the recombinant enzyme was obtained after heterologous expression,with molecular weight of about 55 kDa and crude enzyme activity of 6.28 U/mL.The study indicates that the experiment realizes the heterologous expression of endoglucanase gene on basis of obtaining acid-resistant and high-cellulase active strains,which can provide reference for large-scale production and application of cellulase.Key words:straw;cellulose;degradation;endoglucanase;heterologous expression我国农作物秸秆的产量高，各类农作物秸秆的年均总量可达8.65亿t1。秸秆纤维素作为一种有机碳水化合物，是农作物秸秆的主要成分2。农作物秸秆的综合化利用，如肥料化、饲料化、能源化、基料化和原料化等，备受关注3。秸秆饲料化是利用活菌制剂或生物酶制剂将难以利用的纤维素大分子分解为小分子多糖，并通过菌体生物量的增长提高饲料的蛋白含量4。秸秆类饲料作为粗饲料资源，可有效弥补畜牧业饲料的短缺，支撑草食畜牧业的可持续发展5。毛婷等6研究发现，利用产纤维素酶菌株进行混合发酵降解秸秆纤维素，提升其饲用价值。王啸林等7研究发现，使用乳酸菌和纤维素酶混合青贮发酵马铃薯渣和玉米秸秆能够改善其营养品质和发酵品质。但目前已发现的秸秆纤维素降解菌株普遍存在诱第一作者：张超，博士，研究方向为微生物和生物酶催化。基金项目：河北省大中学生科技创新能力培育专项（项目编号：22E50269D）；河北省高等学校科学技术研究项目（项目编号：ZC2021023）；衡水市科技计划项目（项目编号：2021014009Z）；衡水学院 2020 高层次人才科研启动基金项目（项目编号：2020GC21）收稿日期：2022-07-24试验研究NO.02 202390饲料研究 FEED RESEARCH导产酶时间长、酶活性较低、纯化困难等问题8。本研究以玉米秸秆粉为唯一碳源，从土壤中筛选秸秆纤维素高效降解菌株，并克隆其内切葡聚糖酶基因，构建异源表达系统，旨在为秸秆类饲料发酵菌剂新品种的开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验样品土壤样品使用“五点采样法”采自河北省深州市（38N115E）玉米秸秆堆砌农田。1.1.2培养基富 集 培 养 基：(NH4)2SO4 2 g/L、MgSO4 0.5 g/L、K2HPO4 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、玉米秸秆粉 5 g/L，pH 值5.56.0，121 高温灭菌20 min。筛 选 培 养 基：(NH4)2SO4 2 g/L、MgSO4 0.5 g/L、K2HPO4 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、羧 甲 基 纤 维 素 钠（CMC-Na）5 g/L、琼脂粉18 g/L，pH值5.56.0，121 高温灭菌20 min。发 酵 培 养 基：蛋 白 胨 5.0 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、MgSO4 0.5 g/L、K2HPO4 1 g/L、NaCl 0.5g/L、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5 g/L，pH值5.56.0，121 高温灭菌20 min。1.1.3菌株、质粒和试剂大肠杆菌（Escherichia coli）DH5和BL21（DE3）、pCold 表达载体由本实验室保存；pEASY-T1 Cloning Kit购自北京全式金公司。刚果红、CMC-Na购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白胨购自生工生物工程（上海）股份有限公司；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。1.2测定指标及方法1.2.1秸秆纤维素降解菌株的富集和筛选富集：称取 1 g 样品，置于 50 mL 富集培养基中，30、120 r/min培养23 d。每隔72 h传代1次，传代3次后涂布分离。初筛：吸取1 mL富集培养液梯度稀释至10-7，选取10-3、10-5、10-7稀释液涂布筛选培养基平板，30 培养48 h。挑取单菌落接入0.5 mL发酵培养基，挑菌后的平板进行刚果红染色初筛，测量透明圈直径和菌落直径，选取两者比值的单菌落进行复筛。复筛：将初筛菌株接入2 mL发酵培养基中，30、200 r/min培养48 h，12 000 r/min离心2 min，上清液即为粗酶液。取粗酶液进行纤维素酶酶活测定，选取酶活最高的菌株作为目的菌株进行后续试验。1.2.2纤维素酶酶活酶活采用3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS）法9测定，向 试 管 中 加 入 1%CMC-Na/乙 酸-乙 酸 钠 缓 冲 液（100 mmol/L，pH 值 5.0）0.5 mL、粗酶液 0.5 mL，于37 C水浴中反应10 min，取出，加入3.0 mL DNS终止反应，沸水浴5 min，冷却，540 nm处测量吸光值。根据葡萄糖标准曲线回归方程，计算还原糖质量浓度。酶活力单位（U）定义为：在上述条件下每分钟催化底物生成1 mol还原糖所需酶量为1个活力单位。1.2.3菌株鉴定形态学和生理生化鉴定：目的菌株平板划线培养后观察其菌落形态，挑取单菌落涂片进行革兰氏染色，使用光学显微镜观察、记录菌体形态。通过细菌微量生化鉴定管，参照常见细菌系统鉴定手册进行目的菌株的生理生化鉴定。16S rDNA鉴定：使用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取目的菌株基因组DNA，并以其为模板，利用通用引物27F/1492R扩增目的菌株16S rDNA序列，扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果经拼接去杂后进行Blast序列比对，选取高相似性模式菌株序列，利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建系统发育树。1.2.4菌株粗酶液酶学性质研究1.2.4.1酶反应的最适温度和温度稳定性最适反应温度：将1%的底物溶液与粗酶液混合，分别在25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 条件下，反应10 min，DNS法测定酶活。每个温度条件设置两个平行，取均值确定酶的最适反应温度，并将最高酶活记为100%，用于计算其他温度的相对酶活。相对酶活=处理酶活/最高酶活100%(1)温 度 稳 定 性：使 用 乙 酸-乙 酸 钠 缓 冲 液 体 系（100 mmol/L，pH值5.0）作为反应体系，将粗酶液分别置于40、45、50、55、60、65、70 下保温1 h，测定酶活，计算相对酶活。1.2.4.2酶反应的最适pH值和pH值稳定性最适反应pH值：所用缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液体系（pH 值 4.0、5.0），Tris-HCl（pH 值 6.010.0）。粗酶液分别与pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0缓冲剂的底物溶液混合，55 条件下反应10 min，DNS法测定酶活。每个pH值条件设置2个平行，取均值确定酶的最适反应pH值，并将最高酶活记为100%，用于计算其他pH值的相对酶活。pH值稳定性：将酶液保存于不同pH值的缓冲液中，于4 中放置2 h，在最适pH值和最适温度下测定酶活，以最高酶活记为100%，计算相对酶活。1.2.5内切葡聚糖酶基因的克隆与表达扩增：根据菌株鉴定结果和NCBI已登录的芽孢杆菌属-1,4-endoglucanase 基因序列（登录号：DQ782954,KY797654,AY766381），使用 Pri