ACE2、PRR和AT2R在肾癌干细胞中的表达_孙爱军.pdf

基金项目：辽宁省自然科学基金指导项目，项目编号：。作者简介：孙爱军（），男，辽宁鞍山人，副主任医师，硕士学位，主要研究方向为肾癌的发生机制及治疗。通讯作者：佟明（），男，辽宁锦州人，教授，博士学位，主要研究方向为泌尿系统肿瘤及治疗。、和 在肾癌干细胞中的表达孙爱军，佟明（锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州；鞍山市肿瘤医院，辽宁 鞍山）摘要：目的 探讨肾素血管紧张素系统（，）成分在肾透明细胞癌（，）中的肿瘤干细胞（，）上的表达情况，为 抑制剂治疗 提供理论依据。方法选出既有石蜡标本又有新鲜冷冻标本的 组织样本。对样本的 成分：肾素（）、肾素原受体（，）、血管紧张素转换酶（，）、血管紧张素转换酶 （，）和血管紧张素 受体（，）行免疫组化染色。用 或 作为 标志物分别和以上 成分进行免疫荧光共染色或免疫组化双染色。采用 和 技术定量研究 组织样本中这些 组分的蛋白和基因表达情况。结果 免疫组化染色显示，份 样本中分别有 份、份和 份表达肾素、和。所有 份样本均表达，只在正常组织血管的内皮细胞中表达。双免疫组化双染色显示 定位于 上，肾素不表达在 上。免疫荧光染色显示 和 定位于 上。证实除了肾素外，以上 的蛋白成分都有表达。显示了所有 组分的转录表达，但 未见表达。结论 中 表达、和，通过靶向 调控 可能成为一种新的治疗 的方法。关键词：肾透明细胞癌；肾素血管紧张素系统；肿瘤干细胞中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，；，）：（）（）（），（），（），（）（），：；肾细胞癌（，）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其中以肾透明细胞癌（）发生的比例最高。目前，的治疗效果仍取决于肿瘤的临床分期和分级。局灶性锦州医科大学学报 （）DOI:10.13847/ki.lnmu.2023.01.019肿瘤可通过部分或全肾切除术方式治疗，而传统化疗和放射疗法的作用很小。而且，以上治疗的疗效均存 在 较 大 差 异 性。近 年 来，肿 瘤 干 细 胞（）的研究为肿瘤的发生理论以及治疗提供了一个崭新的视野。研究证明在 中存在，并具有降低放疗和化疗治疗中 的抵抗或耐药作用。最近，在 中发现了 的亚群，其表达转录因子、和 等干细胞相关标记物。此外，在许多类型的癌症中都表达肾素 血管紧张素系统（）成分。其中肾素、肾素原受体（）、血管紧张素转换酶（）、血管紧张素 受体 （）和血管紧张素 受体 （）都与癌症的发生有关。本研究拟观察 成分在 以及 细胞中的表达情况，为进一步寻找靶向 途径的新治疗方案，改善 疾病提供参考依据。实验材料与方法 组织样本和试剂仪器选取 患者的石蜡样本和低温冻存的样本，例来自女性，例来自男性，年龄 岁（平均 岁），肿瘤分级全部为 级，分期，都没有淋巴远处转移。所选取的患者样本均是首次发病且术前未经过药物或放化疗。组织标本再次由两名有经验的病理学医师仔细分析，最终确定肿瘤的组织类型。兔抗、抗体，鼠抗 抗体，山羊抗 抗体，显示试剂（红），显色试剂（棕），标记山羊抗兔，标记驴抗兔，抗鼠 ，抗兔 均购于北京博奥森公司。试剂盒，、显色试剂盒、试剂盒、试剂盒、购于北京天恩泽公司。设备有石蜡切片机、组织匀浆器、仪、显微镜、微孔板酶标仪、激光共聚焦显微镜、分子成像系统、分光光度计。组织学及免疫组化染色 石蜡样本行 厚连续切片，染色观察，再次确定肿瘤类型。下烤片，用二甲苯脱蜡和乙醇复水。用 的柠檬酸钠缓冲液修复抗原。用 过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性 ，然后用 血清阻断 。组织分别与相应的一抗孵育：肾素、和 （），冰箱过夜。次日用 标记的二抗室温下孵育 ，进行显色，苏木精复染细胞核，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。同时，将上述肾素和 抗体以相同的稀释浓度分别与 （）进行免疫组化双标染色，观察肾素和 在 中的共定位情况，二抗标记染色。和 显色试剂进行显色。免疫荧光双标染色干细胞标志物 分别与上述 成分进行共免疫荧光双标染色，观察 成分和 在 上的定位表达情况。一抗采用上述免疫组化染色中检测 抗体成分相同的浓度进行，分别与 （）于 冰箱内孵育过夜。二抗采用免疫荧光标记的抗鼠 和抗兔 （）。激光共聚焦显微镜下观察并拍照。图像获取与免疫组织化学染色评估采用显微镜、数码相机以及系统自带软件对免疫组化染色玻片进行拍照获取图片。免疫荧光染色采用生物共聚焦激光扫描显微镜观察成像，系统软件进行计算处理。所有免疫组化 荧光图像的评估均由两名研究人员独立进行，采用盲测法，即评估人员对患者的临床病理和预后数据均不知情。当染色评估出现分歧时，由两名专家重新检查切片最终达成一致意见。分析取冷冻 组织样本，使用组织匀浆器对每个样本进行快速冷冻组织匀浆处理。然后，用 溶液提取总。脱氧核糖核酸酶消化。使用分光光度计对 进行定量。逆转录成，将目的基因进行转录扩增，反应条件：预变性 ，总共循环 次。基因表达内参基因为 和。人组织的总 （）作为 参考值，用作 分析的校正基值。使用 琼脂糖凝胶电泳和 软件进行分析。计算、及 的相对表达量。各种基因的引物序列（）：上游，下游；：上游 ，下游；：上 游，下游；锦州医科大学学报 年 月，（）：上 游，下 游；：上游；下游；：上游；下游 ；：上游，下游 ；：上 游；下游 。检测另取冷冻 样品置于冷的缓冲液中，研磨提取总蛋白，试剂盒蛋白定量。总蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到聚二氟乙烯膜。使用、和 微管蛋白一抗（）进行孵育。、和 采用辣根过氧化物酶（）标记山羊抗兔二抗（），用 标记的驴抗兔，微管蛋白用 标记的驴抗鼠（）进行检测。进行显色，软件对条带进行检测和分析。统计学方法对于满足正态性、方差齐性多组数据间比较，采用方差分析（）。对于不符合正态性或方差不齐的数据采用非参数的单因素方差分析并行 检验。两两比较采用事后 检验，以 为差异有统计学意义。结 果 肾素、和 在 中免疫组化表达对 例 患者的临床一般资料进行分析，性别、年龄、肿瘤分级和分期都没有统计学差异，见表。经 染色证实选取的所有组织样本均为。免疫组化染色显示 例 样本肾素呈弱中度胞浆染色（见图）。有 例显示 呈胞浆表达，染色强度不同（见图）。在所有样本中，均在正常血管的内皮处表达，而在肿瘤组织内均未见表达（见图）。在 例样本中 表现为非均质的膜染色，其中有 例带有颗粒状胞浆染色（见图）。在全部肿瘤样本中均表达，染色模式表现为胞浆染色，其中 例有个别核染色（见图）。表 例肾透明细胞癌患者的临床一般资料项目 百分率（）性别男 女 肿瘤分级 期 期 肿瘤分期 现状生存 死亡 、和 在 中共表达情况免疫组化双染显示 组织样本中，的 上未见肾素表达（图）。而 的 中 也同时呈阳性表达（见图）。阳性对照显示肾素在支气管中为胞浆染色阳性（见图），在肾脏中呈胞浆染色阳性（见图），在结肠上皮中为核染色阳性（见图）。同型阴性对照在支气管、肾脏和结肠均未见染色（见图 ）。免疫荧光染色显示，在 组织样本中，的 胞浆中可见 表达于胞浆中（见图），主要表达于的 胞核内（见图）。孙爱军，等：、和 在肾癌干细胞中的表达：肾素，表达在肿瘤细胞胞浆中，呈棕色染色；：，肿瘤细胞胞浆呈棕色染色；：，肿瘤内未见表达；：，主要表达在肿瘤细胞的胞膜和胞浆中；：，表达在肿瘤细胞的胞浆和胞核中；：同型阴性对照，标尺：图 肾透明细胞癌组织免疫组化图像：（棕色）的 上不表达肾素（红色）；：（棕色）的 表达 （红色），标尺：图 免疫组化双染色图：肾素阳性对照，人支气管（红色）；：阳性对照，肾脏（红色）；：阳性对照，结肠上皮（棕色）；：同型阴性对照显示支气管（无红色）；：同型阴性对照肾脏；：结肠上皮无染色（无棕色），标尺：图 免疫组化双染色阳性和阴性对照图锦州医科大学学报 年 月，（）：（红色）和 （绿色）共表达于 上；：（绿色）上同时有 表达（红色），标尺：图 免疫荧光双标染色图、和 基因表达与健康人的 相比，肾素 水平升高（见图）。份 组织样本中有 份检测到肾素。其中 个样本的表达水平与健康 相当，而其他 个样本高于健康 的表达水平。只有 个样本检测到。在健康的 中检测到，然而所有 样本中均未检测到。产物凝胶电泳特异性扩增图，可观察到符合预期大小的扩增条带，见图。图 检测肾素、和 基因表达：肾素；：；：；：；：；：；：；：；列为各组织样本；：人通用 内参；：阳性对照；：无模板对照图 扩增 组织样本 成分 的表达 中、和 免疫印迹表达 显示在 组织样本表达了、和 蛋白，表现为在、和 的预期分子量位置出现了目标条带（见图）。其中 在所有样本的 位置上表达，部分样本发现在 位置上有全长同型跨膜结构的表达。在 个 中，有 个样品在 位置上检测到 表达（见图）。所有 中有 个在 位置检测到 表达（见图）。在所有样本中，有 个样本在约为 的位置检测到了 表达（见图）。用各种抗体对肾素进行免疫印迹检测，未能观察到单一的特异性条带。微管蛋白在每个样品中的总蛋白载量基本相同。孙爱军，等：、和 在肾癌干细胞中的表达：（红色）；：（红色）；：（红色）；：（红色）；：（红色）图 肾透明细胞癌组织中，表达的免疫印迹图 讨 论本研究证实了在 中可以检测到 的 种成分即：肾素、和，其中、和 定位于 中表达、的 上。这些结果为 与肾脏癌变之间的关联提供了较直接的证据。免疫组化染色显示：全部的 组织标本中均有 表达，大部分标本中有、表达。对冷冻保存的 标本进行免疫印迹和 检测，证实了免疫组化染色检测到的 和 蛋白的 水平上的表达。在部分样本中，免疫印迹法证实了 的表达，然而 法却未检测到 的 表达。免疫印迹法未检测到肾素表达，但是用 却证实了其转录水平上有表达。我们发现 在免疫印迹条带上出现在 和 位置上，而 预期印迹条带（分子量）包括大约 的可溶性亚型和 的跨膜形式。又由于 条带在阴性对照和兔 同型对照中均未能检测到，所以免疫印迹法检测到的 条带表明 蛋白可能是以降解的形式存在。通过进一步的分析，我们认为免疫印迹法和 法检测的 表达结果反映的可能是免疫组化染色中所见的正常血管组织的表达，而不是肿瘤本身的表达。如免疫印迹所示，表达 的样本同时也表达，这与文献的报道相一致。免疫印迹中发现在 的位置处检测到，这比 的 理论分子量更大，原因应该是其存在糖基化形式。通过同型对照试验证实了额外的非特异性带的出现。免疫组化双染色 显 示 的 表 达，即 和 共表达。免疫荧光共染色显示 和 定位于 中的 的 上。免疫组化双染色未见肾素表达，这可能是由于 过染，可能掩盖了单一免疫组化染色显示的肾素弱染色。也可能是由于抗体相互作用干扰了单一免疫组化染色。我们没有在肿瘤内部检测到，然而，在周围正常的血管组织中却能检测到它，这与其他人的报道一致。这提示在 中 功能缺失，但这也并不排除 向 的局部转化的可能。因为有一些酶，如乳糜酶可以促进或构成 的旁路转化途径。在 中 的表达表明、表达与生存期无显著相关性。然而，本研究有限的样本量限制了我们的研究与存活率的相关性分析。最近的一项研究也发现，在 中 表达增加，并且表达增加与生存率提高相关。这些发现也在其他的研究中有所反映，其中 中 的下调与生存率较差相关。此外，通过免疫组化和免疫荧光染色，在 的细胞质和细胞核中均发现了 偶联跨膜蛋锦州医科大学学报 年 月，（）白。这表明 作为跨膜蛋白和核受体在功能上存在不同的定位。有人认为，的核定位可能通过转录调控放大膜性 的作用或调节膜性 的激活。免疫印迹检测到 表达较弱，而 则没检测到。这可能是由于本研究使用的 引物可能没有完全覆盖 所有可能的剪接变异体。另外，降解可能导致了 的缺失从而造成检测不到。在 中检测到 的低水平表达也与 对癌症的保护作用相一致，但是具体的原因和机制仍需要进一步研究。由于同时具有新鲜冷冻组织标本和石蜡标本的样本不是太多，最终导致本研究的样本数量不是很充分。对肿瘤的亚群进一步分析和研究则需要收集更大的样本量。最后，本研究结果提示通过调控 成分，有可能成为一个新的潜在的治疗靶点。参考文献：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，：，（）