基于转录组技术的枫叶鲑亲本鉴定和杂交优势分析_刘玉猛.pdf

基于转录组技术的枫叶鲑亲本鉴定和杂交优势分析刘玉猛1，蒋洁兰2，3，毛明光2，3*，朱诗裕3，王 伟1(1大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁大连 116023;2海南热带海洋学院崖州湾创新研究院，海南三亚 572024;3海南热带海洋学院/海南热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室，海南三亚 572022)摘要为探究枫叶鲑的亲本来源及杂种抗病优势，采用 Illumina 高通量测序技术对枫叶鲑的胸腺和头肾组织转录组进行测序分析。结果获得胸腺组织原始数据 8 224 345 800 bp，拼接获得 169 204 条单基因序列(Unigene);头肾组织原始数据 7 409 864 400 bp，拼接获得132 292 条 Unigene。利用生物信息学方法对 Unigene 进行 N 库相似搜索，还进行了 GO、KOG 和 KEGG 分类注释。通过比对线粒体DNA(mtDNA)基因序列发现，枫叶鲑与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的线粒体基因同源性达 99%以上，可判定枫叶鲑母本是虹鳟;E3、TNF、IGM 等基因的同源性在大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)中比虹鳟高，推测枫叶鲑父本可能是大鳞大麻哈鱼。对免疫相关基因分析发现，IgM、TNF 和 T、B 淋巴细胞相关基因序列与父、母本同源性均较高，因此初步判定枫叶鲑抗病优势是父、母本双方杂交的结果。通过转录组分析杂交种的抗病优势存在盲区，但该技术可以快速判断父、母本的来源，获得大量遗传信息，优势明显。关键词枫叶鲑;转录组;亲本鉴定;抗病优势分析中图分类号S9174文献标识码A文章编号05176611(2023)01009806doi:103969/jissn05176611202301021开放科学(资源服务)标识码(OSID):Parental Identification and Hybrid Vigor Analysis of Maple Salmon Based on Transcriptome TechnologyLIU Yu-meng1，JIANG Jie-lan2，3，MAO Ming-guang2，3et al(1College of Ocean Technology and Environment，Dalian Ocean Universi-ty，Dalian，Liaoning 116023;2Yazhouwan Innovation esearch Institute，Hainan Tropical Ocean University，Sanya，Hainan 572024;3KeyLaboratory of Utilization and Conservation for Tropical Marine Bioresources，Ministry of Education/Hainan Tropical Ocean University，Sanya，Hainan 572022)AbstractIn order to explore the parent origin and hybrid disease resistance of maple salmon，Illumina high-throughput sequencing technologywas used to sequence and analyze the transcriptome of thymus and head kidney tissues of maple salmonThe original data of thymus tissue was8 224 345 800 bp，and 169 204 Unigene were obtained by splicing;the original data of head kidney tissue was 7 409 864 400 bp and 132 292Unigenes were obtained by splicingUsing bioinformatics method，we searched the N database of Unigene，and annotated GO，KOG andKEGGBy comparing the mitochondrial DNA(mtDNA)gene sequence，it was found that the mitochondrial gene homology of Oncorhynchusmykiss and maple salmon was more than 99%，and it could be determined that the female parent of maple salmon was rainbow trout;the homol-ogy of E3，TNF IGM and other genes in Oncorhynchus tshawytscha is higher than that in rainbow troutIt is speculated that the male parentof maple salmon may be Oncorhynchus tshawytschaAnalysis of immune related genes revealed that IgM and TNF sequences of genes relatedto T and B lymphocytes are highly homologous with their parents，so it is preliminarily determined that the disease resistance of maple salmonis the result of hybridization between parentsThere is a blind spot in the disease resistance advantage of hybrids by transcriptome analysis，butthis technology can quickly determine the source of parents and mothers，obtain a lot of genetic information，and has obvious advantagesKey wordsMaple salmon;Transcriptome;Parent identification;Disease resistance advantage analysis基金项目海南热带海洋学院崖州湾创新研究院开放课题(2022CXYK-FKT06);海南省自然科学基金项目(322C716，422MS083);海南热带海洋学院引进人才科研启动资助项目(HDC202119，HDC202206)。作者简介刘玉猛(1996)，男，湖南郴州人，硕士研究生，研究方向:海洋生物学。*通信作者，副教授，硕士生导师，从事海洋生物学研究。收稿日期20220207鲑鳟，是鲑鱼和鳟鱼的统称1。我国鲑鳟养殖是从 20世纪 60 年代开始的，经历了 60 多年的发展，已经形成了一定的产业规模，并带来了巨大的经济效益2。随着国内需求的增加，养殖体量也不断增加，2018 年我国第一个深海网箱建成并投入使用3，我国鲑鳟受精卵受制于欧洲，苗种是目前亟待解决的问题，优质的苗种可为下游养成打好基础和保障。丹东华美渔业有限公司位于丹东市鸭绿江畔，该公司以鸭绿江为基地，从国外引种优质杂交鲑，并进行了推广养殖，是当地重要的创汇来源之一。其引进的杂交鲑优点明显，生长速度快，抗病力强，肉质优良，因肉色似枫叶的颜色，故名“枫叶鲑”。由于枫叶鲑属于外来物种，且商业品系的信息不全面，尤其是其遗传信息不明确，这为我国自主繁育造成了瓶颈，也对该地区物种来说是一种潜在的风险。转录组测序技术已广泛应用于生物学领域45，但其在鱼类亲子鉴定方面鲜见报道。笔者利用Illumina 高通量测序技术对枫叶鲑胸腺和头肾组织进行转录组测序，通过转录本拼接、基因功能注释，揭示枫叶鲑的基因表达特点，根据线粒体母源传递的特点，通过对转录组中线粒体基因比对分析，确定其母本来源，并根据免疫相关基因的转录探讨枫叶鲑抗病优势的原因，旨在为今后利用转录测序技术快速揭示未知来源物种的遗传信息提供科学依据。1材料与方法11试验材料枫叶鲑由丹东华美渔业有限公司提供，为400 g。采样所需的手术剪、咬骨钳、镊子等器械均事先通过高压灭菌锅进行 121，2 h 灭菌，采样前使用 75%乙醇擦拭且经火焰消毒。将试验鱼解剖，分别取胸腺和头肾组织储存于 10 倍体积的 NA later。12试验方法121总 NA 的提取及质量检测。利用 NA 提取试剂盒提取枫叶鲑胸腺和头肾的总 NA。为了保证试验数据的高质量，将上述提取的 NA 用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计检测其纯度与浓度。将检验合格的 NA 用安徽农业科学，JAnhui AgricSci 2023，51(1):98103，106于构建 cDNA 文库。将上述 cDNA 文库利用 Qubit DNA 检测试剂盒对回收的 DNA 精确定量，以方便按照 1 1 的比例等量混合后进行测序。122文库质检和测序。将上述检验合格的 cDNA 文库在Illumina 平台进行测序，首先过滤原始数据中低质量、末端质量低、含测序引物的 reads，得到 clean reads，然后再进行 denovo 拼接，最后通过 CAP3 软件拼接来获得最终 Unigene 序列集合6。cDNA 文库构建与测序由生工生物工程(上海)股份有限公司协助完成。123转录组数据质控与组装。测序得到的原始数据中含有带接头的、低质量的序列去除带 N 碱基的序列;去除reads 中的接头序列;reads 35去除低质碱基(Q 值20);reads 53去除低质碱基(Q 值20);去除 reads 长度小于35 nt 的 reads 及其配对 reads。为了保证信息分析质量，必须对原始数据过滤，得到 Clean 数据。124基因功能注释和分类。利用BLAST 软件7 将Unigene序列分别与 N(NCBI non-redundant protein sequences)7、NT(NCBI non-redundant nucleic acid sequences)7、GO(Geneontology)7、KEGG(kyoto encyclopedia of genes and ge-nomes)8、KOG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)9、Uniprot(universal protein)10 以及 PFAM(protein family)11 7个数据库进行比对分析，获得 Unigene 的注释信息，并对基因功能进行分类。获取枫叶鲑胸腺和头肾基因序列与近缘物种基因序列的相似性以及枫叶鲑胸腺和头肾基因的功能信息，并按照分子功能、细胞组分和生物过程 3 个大类对其进行 GO 功能分类。此外，还进行了 KOG 功能分类，同时获得KEGG 代谢通路分析结果。125基于转录组测序的枫叶鲑亲本鉴定和杂种抗病优势分析。通过对转录组测序结果数据进行筛选以及利用BLAST 软件进行比对分析，将筛选得到的线粒体 DNA(mtD-NA)基因序列和基因组基因序列在 NCBI 数据库中进行比对，分别确定枫叶鲑的母本及父本来源。将筛得到的免疫相关基因序列进行比对分析，探讨枫叶鲑所具有的抗病优势来源。2结果与分析21样本原始数据统计及数据质控采用双端测序法并经过质量控制后12，共获得胸腺的 729 Gb 总碱基数，GC 含量为 4773%，Q30 碱基比例