基于下游实验的样本质量分析_刘丽.pdf

基于下游实验的样本质量分析刘 丽1,2,林金嬉1,2,梁宪红1,2,李上智1,2,乔 琳1,2,佟 玲1,2,秦海强1,3(1.首都医科大学附属北京天坛医院,北京1 0 0 0 7 0;2.国家神经系统疾病临床医学研究中心,北京1 0 0 0 7 0;3.首都医科大学附属北京天坛医院神经病学中心,北京1 0 0 0 7 0)D O I:1 0.1 1 7 4 8/b j m y.i s s n.1 0 0 6-1 7 0 3.2 0 2 2.1 1.0 2 8收稿日期:2 0 2 2-0 9-0 3;修回日期:2 0 2 2-0 9-3 0基金项 目:国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目(编 号:8 1 8 7 0 9 0 7,8 2 2 7 1 2 9 9);“十 三 五”国 家 重 点 研 发 计 划 项 目(编 号:2 0 1 6 Y F C 1 3 0 1 6 0 4)通讯作者:秦海强。E-m a i l:q h q_b j 1 6 3.c o m摘要:目的 依据I S O2 0 3 8 7生物样本库通用要求,通过下游实验对现有的白细胞提取质量进行验证,探索适用于生物样本库认可的样本前处理方法。方法 对2 0 2 1年1月至2 0 2 2年6月使用白细胞进行靶向捕获测序的样本进行D NA提取,通过O D 2 6 0/2 8 0、O D 2 6 0/2 3 0、测量浓度,计算得率对D NA质量进行评价。结果 5 8 5 0例白细胞提取D NA,纯度足够高的样本占比为8 6.2 4%,得率大于1 0g满足实验需求的样本占比为9 2.5 1%。结论 将红细胞裂解步骤提前,在新鲜样本时进行,使用纯度较高的白细胞进行D NA提取,通过验证,上述提取方法可行,高纯度样本有效减少了红细胞的干扰,为样本库探索未知研究提供更为可靠的生物样本。关键词:质量;验证;D NA中图分类号:R 3 9 3-3 3 文献标识码:AA nA n a l y s i so fS a m p l eQ u a l i t yB a s e do nD o w n s t r e a mE x p e r i m e n t sL I UL i1,2,L I NJ i n x i1,2,L I ANG X i a n h o ng1,2,L IS h a ngz h i1,2,Q I AOL i n1,2,T ONGL i ng1,2,Q I N H a iqi a ng1,3(1.B e iji ngT i a n t a nH o spi t a l,C api t a lM e d i c a lU n i v e r s i ty,B e iji ng1 0 0 0 7 0,C h i n a;2.N a t i o n a lC l i n i c a lR e s e a r c hC e n t e r f o rN e u r o l ogi c a lD i s e a s e s,B e iji ng1 0 0 0 7 0,C h i n a;3.D epa r t m e n to fN e u r o l og yo fB e iji ngT i a n t a nH o spi t a l,C api t a lM e d i c a lU n i v e r s i ty,B e iji ng1 0 0 0 7 0,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v eT ov e r i fyt h equ a l i tyo ft h ee x i s t i ngl e u k o cyt ee x t r a c t i o ns a mpl e st h r o ughd o w n s t r e a me xpe r i m e n t sa c c o r d i ngt ot h ege n e r a lr equ i r e m e n t so fI S O 2 0 3 8 7b i o b a n k s,a n dt oe xpl o r et h es a mpl epr e t r e a t m e n tm e t h o d s t h a ta r es u i t a b l ef o rb i o b a n kap pr o v a l.M e t h o d sF r o mJ a n u a ry,2 0 2 1t oJ u n e,2 0 2 2,D N Aw a s e x t r a c t e df r o ms a mpl e s u s i ngl e u k o cyt e s byt a rge t e dc apt u r e s equ e n c i ng,a n d t h eD N Aqu a l i tyw a se v a l u a t e dbyO D 2 6 0/2 8 0,O D 2 6 0/2 3 0,m e a s u r e dc o n c e n t r a t i o n,a n dc a l c u l a t e dyi e l d.R e s u l t sD N A w a se x t r a c t e df r o m5 8 5 0c a s e so f l e u k o cyt e s,i nw h i c ht h epr opo r t i o no f s a mpl e sw i t hs u f f i c i e n tpu r i tyw a s8 6.2 4%,a n d t h epr opo r t i o no f s a mpl e sw i t hayi e l dgr e a t e r t h a n1 0 ugt om e e t t h ee xpe r i m e n t a l r equ i r e m e n t sw a s 9 2.5 1%.C o n c l u s i o nO u r r e s u l t s s ug ge s t t h a t t h e r e db l o o dc e l l lys i s s t eps h o u l db e c a r r i e do u t i na d v a n c e,a n d i t i s c a r r i e do u t i n f r e s h s a mpl e s,a n dD N Ae x t r a c t i o nw i t hh ighpu r i tyw h i t eb l o o d c e l l s i s h e lpf u l.A f t e rv e r i f i c a t i o n,t h i s e x t r a c t i o nm e t h o di s f e a s i b l e.T h eh ighpu r i tys a mpl e sc a nr e d u c et h ei n t e r f e r e n c eo fr e db l o o dc e l l s a n dpr o v i d e t h e s a mpl e l i b r a ryf o r e xpl o r i ngu n k n o w nr e s e a r c h.M o r er e l i a b l eb i o l ogi c a l s a mpl e sc a nb epr o d u c e dw i t ht h i sm e t h o d.K e yw o r d s:Q u a l i ty;V a l i d a t i o n;DNA 现代医学研究表明,除外伤外,几乎所有疾病均与基因相关。无论是队列研究,还是回顾性研究,越来越多的临床研究都涉及基因检测,包括确诊疾病分型、预测疾病风险等,很多研究周期长达数年。生物样本库为这些研究提供了宝贵的生物样本,因此生物样本的质量已成为基因组学、蛋白组学、转录组学等研究的基础。2 0 1 8年8月由国际标准化组织(I S O)正式发布了生物样本库认可体系I S O2 0 3 8 7B i o t e c h n o l o g y B i o b a n k i n g G e n e r a lR e q u i r e m e n t sf o rB i o b a n k i n g(生物样本库通用要求),其中提出2491L a b e l e dI mm u n o a s s a y s&C l i nM e d,N o v.2 0 2 2,V o l.2 9,N o.1 1当生物样本库为关键活动提供/应用方法时,生物样本库首 先 应 确 认 这 些 方 法 是 否 能 够 满 足 预 期 要求1,并针对样本用途选择合适的提取保藏方式来提供质量合格的样本,从而满足下游实验的使用。目前国外有一些关于样本采集处理保藏方法对样本质量影响的报道2-4,但是国内样本库很少在使用样本前对样本质量进行分析,样本提取保藏方法是否合适没有统一标准,仍处于探索过程中。北京天坛医院样本库起步于2 0 0 9年成立的北京脑血管病临床数据与样本资源库,是最早一批在科技部进行人类遗传资源保藏备案的样本库。天坛神经系统临床生物样本库是目前全球最大的神经系统疾病临床研究重要支撑平台之一,已收集来自全国多中心近9万人次临床生物资源,为脑血管病精准医学提供可靠的生物样本5,本文对2 0 2 1年1月至2 0 2 2年6月期间提交使用申请的白细胞样本使用情况进行统计归类,其中下游实验进行靶向捕获测序的样本量最大,为5 8 5 0例,样本采集时间覆盖2 0 1 1年至2 0 2 1年,1 0年间所有样本均保藏于超低温冰箱内(-8 0),本文对使用的5 8 5 0例白细胞样本进行D NA提取,在样本分析前进行质量控制,因为无统一提取标准6-8,所以根据下游实验要求,对D NA的纯度、得率进行分析,对是否满足下游实验需求进行统计分析,验证现有的提取保藏方法是否合适,探索适用于生物样本库的前处理方法。材料和方法 1 样本来源 本研究选取5 8 5 0例白细胞样本(白细胞提取时间为2 0 1 1年至2 0 2 1年),为北京天坛医院样本库于2 0 2 1年1月至2 0 2 2年6月期间提取,且白细胞使用申请中下游实验需求最大的靶向捕获测序样本,所有样本均为北京天坛医院住院患者清晨空腹采集外周静脉血6 m L于E D T A抗凝管中,采血后混匀1 0次,防 止 凝 固,之 后 静 置3 0 m i n,26 0 0 r/m i n离 心1 0 m i n,离心后,紫头管从上到下依次为血浆、白细胞层、红细胞,血浆收集单独存放,吸出白细胞层加入6 m L红细胞裂解液进行第一次裂解1 0 m i n,之后26 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,弃掉上清,加入6 m L红细胞裂解液混匀进行第二次裂解,离心后弃掉上清,加入5 m L P B S重悬白细胞,混匀后平均分装到5只冻存管内,2 6 0 0 r/m i n离心5 m i n,弃掉上清,将白细胞冻存到超低温冰箱(-8 0)内。所有样本均未冻融,使用时统一提取D NA。所有样本的采集保藏符合人类遗传资源要求。2 仪器试剂 低速离心机(白洋6 0 0 A),核酸提取仪(T h e r m oF i s h e r,K i n g F i s h e rD u oP r i m e),N a n o d r o p 8 0 0 0(T h e r m oF i s h e r),D NA提取试剂盒(志昂生物B T X D/F X 9 6)。3 方法 3.1 D NA提取 从白细胞中提取D NA,白细胞样本4过夜化冻,向每个样本中加入2 0 0L生理盐水充分涡旋震荡混匀,将混匀后的样本加入提取