基于指纹图谱结合多元统计分...藏年限对广陈皮成分影响研究_李晓芳.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药药效成分及质量评价基于指纹图谱结合多元统计分析的不同贮藏年限对广陈皮成分影响研究李晓芳1，高慧2，朱绍光3，周鸣2，刘亚平2，叶喜德2（1.江西中医药大学附属医院 南昌 330006；2.江西中医药大学药学院 南昌 330004；3.江西新干县三湖镇中心卫生院 吉安 331303）摘要：目的建立广陈皮HPLC指纹图谱及多成分含量测定方法，并结合多元统计分析，研究不同贮藏年限对广陈皮成分的影响。方法色谱条件：采用Syncronis C18色谱柱（4.6 mm150 mm，5 m）；流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脱；流速 1.0 mLmin-1；柱温 30；进样量 5 L；检测波长 330 nm。采用HPLC法建立10批次不同贮藏年限广陈皮药材的指纹图谱，标定其共有峰，进行相似度评价；运用聚类、主成分分析等多元统计方法，综合评价10批广陈皮药材成分变化差异；进一步对 中国药典 指标成分与差异色谱峰中的橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素与5-去甲川陈皮素等5种成分进行含量测定。结果10批广陈皮药材指纹图谱相似度均大于0.990，共标定了19个色谱峰，说明不同贮藏年限广陈皮整体质量相对稳定；聚类分析将10批广陈皮分3类，主成分分析提取4个主成分，累积方差贡献率在89.760%，且通过对照品指认确定了其中4个差异色谱峰。含量测定橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素与5-去甲川陈皮素等成分含量范围分别为 20.940-34.780 mgg-1、0.344-0.517 mgg-1、4.667-7.456 mgg-1、3.592-5.879 mgg-1、0.391-0.710 mgg-1。结论建立的广陈皮指纹图谱和多成分含量测定方法简单、准确，具有良好的稳定性和重复性，可采用聚类分析与主成分分析等多元统计分析方法对不同贮藏年限广陈皮药材的成分变化及质量进行评价，为其质量控制和临床应用提供了参考。关键词：广陈皮 贮藏年限 HPLC 指纹图谱 多元统计分析 含量测定doi:10.11842/wst.20211220008 中图分类号:R284.1 文献标识码:A陈皮为芸香科植物橘Citrs reticlata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，药材分为“陈皮”和“广陈皮（新会陈皮）”，而以广陈皮为质佳。广陈皮为芸香科植物橘的栽培变种茶枝柑Citrus reticulata Chachi的干燥成熟果皮，具理气健脾、燥湿化痰功效1。历代本草典籍记载其以“陈久者良”，如 药鉴2中提到“陈皮须用隔年陈”，又如 本草汇言3载“又他药贵新，惟橘皮贵陈”。然而对其陈化年限的界定，历代本草说法不一，如 1年、2年、3年或数十年等，也有“陈久”、“陈年”、“多年”等4。陈皮因陈化年份不同，其成分和药理活性均有一定差别，对目前于陈皮年份的鉴别常通过感官评价法、近红外光谱或测定其成分组成与含量来鉴别5-7。现代研究中对于陈皮在存放过程中挥发性成分与黄酮类成分研究较多，认为陈皮在贮藏过程含量均会有所变化，但对于其具体的变化趋势，不同学者研究结果不尽相同，结论不一8-12。指纹图谱是中药质量评价与控制的重要方法之一，可以较为全面地表征中药所含化学成分，而与多元统计分析相结合可用于不同基原、不同产地、不同炮制品以及不同贮藏年限的中药材成分差异评价。收稿日期：2021-12-20 修回日期：2022-08-14 江西省中医药管理局科技项目（2020B0405）：基于痰证理论研究江西大红袍之陈皮炮制变化机理；负责人：李晓芳；国家中医药管理局培训项目（T20184828005）：全国中药特色技术传承人才培训（国中医药人教函【2018】204号）。通讯作者：叶喜德，教授，博士生导师，主要研究方向：中药质量标准研究。4233 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 目前文献对广陈皮与陈皮的指纹图谱研究虽较多12-14，但运用指纹图谱并结合化学模式识别方法对不同贮藏年限广陈皮进行研究未见相关文献报道。且无论从本草典籍还是现有研究方面来看，对于陈皮陈化多久方可药用或贮藏多久为质佳仍未明确。基于此，本研究采用指纹图谱结合多元统计分析，对贮藏年限1-10年的广陈皮展开整体性研究，并以主要差异成分含量作为定量测定指标，探究不同贮藏年限对广陈皮成分的影响。同时，依照成分含量变化差异，研究成分含量随时间变化规律，以期为陈皮药材的质量控制标准提供参考，为揭示陈皮“陈久者良”科学内涵提供数据支撑。1 材料 1.1药材与试剂对照品橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素、5-去甲川陈皮素均购于四川省维克奇生物科技有限公 司，批 号 分 别 为 wkq20030407、wkq21060106、wkq20031701、wkq20041611、wkq21052610，纯度均98%。乙腈和磷酸为色谱纯（GRACE公司），实验用水为自制双蒸水。广陈皮（编号S1-S10）购于广东省江门市新会陈皮村市场股份有限公司，经江西中医药大学胡生福副教授鉴定为经鉴定为芸香科植物橘的栽培变种茶枝柑（Citrus reticulata Chachi）的干燥成熟果皮。10批陈皮药材见表1、图1。1.2仪器Agilent 1100高效液相色谱仪（配备VWD紫外检测器，安捷伦化学色谱工作站，美国安捷伦公司）；高速中药粉碎机（型号：YF-111B，瑞安市永历制药机械有限公司）；超声波清洗器（型号KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）；十万分之一电子天平（型号：AE240，美国Mettler-Toledo 公司）。2 方法与结果 2.1色谱条件Syncronis C18色谱柱（4.6 mm150 mm，5 m）；流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸（B）,梯度洗脱（0-28 min，10%-26%A；28-32 min，26%-30%A；32-34 min，30%-40%A；34-55 min，40%-55%A）；流速1.0 mLmin-1；柱温30；进样量5 L；检测波长330 nm。2.2对照品溶液的制备取各对照品适量，精密称重，加甲醇溶解并定容，过0.22 m微孔滤膜。再取上述单一对照品适量，甲醇稀释并定容，制得橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素、5-去甲川陈皮素质量浓度分别为 1.020 mgmL-1、0.020 mgmL-1、0.412 mgmL-1、0.218 mgmL-1、0.018 mgmL-1 的混合对照品溶液。图110批广陈皮药材外观比较表110批广陈皮药材产地与贮藏年限编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10产地新会七堡新会七堡新会七堡新会七堡新会七堡新会七堡新会七堡新会七堡新会天马新会天马贮藏年限1年2年3年4年5年6年7年8年9年10年4234 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药药效成分及质量评价2.3供试品溶液的制备取广陈皮粉末0.50 g（过3号筛），精密称重，加入甲醇20 mL，超声40 min后放冷称重，甲醇补足，取续滤液过0.45 m微孔滤膜，得供试品溶液。2.4指纹图谱方法学考察2.4.1精密度实验取广陈皮粉末（S1），按“2.3”项方法进行供试品溶液制备，以“2.1”项下色谱条件进行测定，连续 6 次。以橙皮苷（10号峰）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间与相对峰面积15，得相对保留时间 RSD 小于0.26%，相对峰面积RSD小于2.78%，表明该仪器的精密度良好。具体见表2。2.4.2重复性实验取广陈皮粉末（S1），按“2.3”项方法进行供试品溶液制备，平行制备6份，以“2.1”项下色谱条件进行测定。以橙皮苷（10号峰）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间 RSD 小于 0.45%，相对峰面积 RSD 小于2.77%，表明该方法的重复性较好。具体见表3。2.4.3稳定性实验取S1的同一份供试品溶液，分别于 0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h，以“2.1”项下色谱条件进行测定，以橙皮苷（10号峰）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间RSD小于0.38%，相对峰面积RSD小于2.65%，表明在 24 h 内供试品溶液具有良好的稳定性。具体见表4。2.5HPLC指纹图谱建立及相似度评价取10批广陈皮粉末，按“2.3”项方法进行供试品溶液的制备，按“2.1”项色谱条件进样测定。将10批陈皮色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以S1为参照图谱，经多点校正与 Mark 峰匹配，共确定了19个共有峰，10批广陈皮的指纹图谱见图2。与橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素等对照品比对，指认出共有峰中的5个色谱峰，如图3，分别为：峰10（橙皮苷）、峰13（甜橙黄酮）、峰15（川陈皮素）、峰18（橘红素）、峰19（5-去甲川陈皮素）。以橙皮苷（峰10）为参照峰，计算10批广陈皮共有峰的相对保留时间、相对峰面积，见表5和表 6。结果得 10 批次样品相对保留时间 RSD 为0.14%-0.54%，相对峰面积的 RSD 为 8.87%-52.07%。以对照图谱为参照图谱，对10批广陈皮的指纹图谱进行相似度评价，得10批样品的相似度均大于0.990，表现出较强的相似性，具体见表7。分析发现，10批不同贮藏年限广陈皮的图谱相似度较高，但部分色谱峰相对峰面积 RSD 大，说明部分成分含量仍存在一定差异。表2精密度实验中各共有峰相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA）共有峰12345678910111213141516171819S1-1RRT0.2950.3350.4150.4830.5300.7290.7840.8150.9411.0001.0221.6651.7541.7631.8651.8851.9442.0202.166RPA0.0780.0630.1160.1320.0850.0550.0430.1190.0331.0000.1520.0840.1410.0811.7690.0630.1921.1500.082S1-2RRT0.2960.3350.4150.4830.5300.7290.7840.8150.9401.0001.0231.6651.7561.7641.8641.8841.9462.0202.166RPA0.0780.0620.1170.1300.0830.0550.0430.1130.0311.0000.1480.0830.1410.0811.7520.0600.1901.1810.081S1-3RRT0.2950.3350.4150.4840.5290.7290.7850.8130.9411.0001.0221.6661.7561.7631.8651.8841.9452.0202.165RPA0.0790.0630.1200.1350.0860.0570.0450.1170.0311.0000.1530.0880.1460.0841.8390.0620.1901.2220.084S1-4RRT0.2950.3360.4140.4830.5310.7280.7860.8140.9411.0001.0231.6651.7561.7641.8641.8851.9452.0212.166RPA0.0800.0590.1150.1280.0840.0580.0420.1150.0311.0000.1450.0840.1420.0841.7820.0610.1