基于阴虚证、阳虚证及卵巢功...模型探讨杜仲雄花的补肾功效_谭丹.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金（；）；上海市自然科学基金（）作者简介：谭 丹（），女（汉族），山西运城人，上海中医药大学中药学院硕士研究生，主要从事中药及复方药效作用机制研究工作通讯作者简介：袁 颖（），女（汉族），江苏无锡人，上海中医药大学中药学院副教授，博士学位，主要从事中药及复方药效作用机制研究工作基于阴虚证、阳虚证及卵巢功能减退小鼠模型探讨杜仲雄花的补肾功效谭 丹，曾 丹，唐利东，杨若妍，王健英，张 磊，袁 颖（上海中医药大学中药学院，上海；上海中医药大学协同创新中心，上海）摘要：目的 探讨杜仲雄花对阴虚证、阳虚证及卵巢功能减退小鼠模型的药效作用。方法 采用连续 天注射琥珀酸钠甲泼尼龙 （）制备阴虚证小鼠模型；连续 天注射琥珀酸钠甲泼尼龙 （）建立阳虚证小鼠模型，并给予杜仲雄花提取物治疗，测定小鼠脾脏的脏器指数，法检测小鼠血清中 和 含量。采用持续 天腹腔注射环磷酰胺 （）制备卵巢功能减退小鼠模型，并给予杜仲雄花提取物治疗 周，法测定小鼠血清中、的含量，并比较卵巢、胸腺、脾脏等脏器指数差异。结果 杜仲雄花低剂量组可升高阳虚证小鼠模型的脾脏指数，升高 水平，降低 水平。杜仲雄花高剂量组对于阳虚证、阴虚证小鼠模型，能改善体重、脾脏和肾脏脏器指数以及 水平。雄花高剂量组恢复卵巢功能低下小鼠动情周期，升高卵巢、胸腺及脾脏等脏器指数，降低血清中 含量，提高 水平，提高卵巢中各级卵泡数量；而杜仲雄花低剂量组可增加体重和卵巢、胸腺及脾脏等脏器指数，增加卵泡数量，但对激素水平改善不明显。结论 杜仲雄花对机体阴阳平衡可能有双向调节作用，可改善生殖功能，推测杜仲雄花具有一定的补肾作用。关键词：杜仲雄花；卵巢功能衰退；阴虚证；阳虚证 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）杜仲 ，又名思仙、木棉、丝棉皮，是杜仲科杜仲属植物，属于我国的特有树种之一。杜仲的传统药用部位是其干燥树皮，味甘，性温，入肝、肾经。杜仲补益肝肾，强筋健骨，在我国已有两千多年的用药历史，在治疗肝肾不足，腰膝酸软及胎动不安等方面均有显著的疗效。现代研究证明，杜仲在降血压、调血脂、降血糖、抗炎、抗氧化和调节骨代谢等方面均有着较好的药理作用。近年研究发现，杜仲在调节骨代谢平衡，治疗绝经后骨质疏松方面效果显著。如盐炙杜仲可提高去势骨质疏松大鼠体内骨形成细胞的分化速度，使骨代谢速度下降。雌激素受体大量存在于成骨与破骨细胞上。由此推测，杜仲在治疗围绝经期骨质疏松方面，发挥了雌激素样作用。杜仲传统药用部位为树皮，具有资源再生的时限性。本草图经中记载：“（杜仲）初生叶嫩时，采食，谓之檰芽。花、实苦涩，亦堪入药”，由此可见，杜仲的嫩叶、花和果实也有入药，但药用极少。目前杜仲叶已收载入药典，而杜仲雄花至今未作为药用，其药性功效也不明确。前期研究发现，法检测显示除木脂素以外，桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸在雄花中的含量均高于皮部含量，杜仲皮与杜仲雄花具有较为相似的抗实验性类风湿关节炎作用。杜仲雄花是否和杜仲类似具有一定的补肾作用还有待研究。本研究拟观察杜仲雄花对肾阴虚、肾阳虚证模型动物的影响及对卵巢功能减退小鼠的作用，探讨杜仲雄花的补肾作用，为其药用提供理论依据。材料与仪器 实实验验动动物物 雌性 级昆明小鼠，体质重（），购自北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司，动物生产许可证编号：（沪），饲养于上海中医药大学实验动物中心，用颗粒饲料和净化水进行喂养，室温 ，空气相对湿度 ，通风良好，光照充足。实实验验用用药药与与主主要要试试剂剂 杜仲雄花，购自湖南省张家界，经上海中医药大学生药教研室吴靳荣副教授鉴定为杜仲科植物杜仲 的干燥雄花。杜仲雄花醇提取物制备：取杜仲雄花 ，加入 倍量的乙醇，加热回流提取 ，提取两次，合并两次滤液，减压浓缩至含生药 ，装入离心管中备用。环磷酰胺（，）：支，批号：；戊酸雌二醇片：片，拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号：国药准字；甲泼尼龙琥珀酸 钠：支，批 号：。试 剂 盒：上 海 朗 顿 生 物 科 技 有 限 公 司，货 号；试剂盒：上海朗顿生物科技有限公司，货号；试剂盒：南京建成生物工程有限公司，货号；试剂盒：南京建成生物工程有限公司，货号。仪仪器器与与设设备备 多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司，型号）；生物显微镜（徕卡显微系统有限公司，型号）。方法 杜杜仲仲雄雄花花对对阴阴虚虚、阳阳虚虚证证动动物物的的影影响响 实实验验动动物物造造模模、分分组组及及给给药药 雄性昆明小鼠适应性喂养 天，阴虚证及阳虚证模型各 只，按体重随机分为正常组、模型组，杜仲雄花高、低剂量组，各组 只。阴虚动物模型建立：除正常组外，其他各组动物后肢肌注甲泼尼龙琥珀酸钠 ，每日 次，共 天。实验第 天开始，雄花高、低剂量组分别灌胃给予杜仲雄花醇提物 ，每日 次，共 天。正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水。阳虚动物模型建立：除正常组外，其他各组动物后肢肌注甲泼尼龙琥珀酸钠 ，每日 次，持续 天。于实验第 天开始给药，杜仲雄花高、低剂量组分别灌胃给予杜仲雄花醇提物 和 ，每日 次，正常组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水，持续 天。动动物物取取材材 阴虚证、阳虚证动物模型均于最后一次给药后，采用眼球摘除法取血，离心后，取上层血清保存于 的 时珍国医国药 年第 卷第 期冰箱中，待测。取脾脏重，计算脾脏脏器指数。检检测测指指标标 各各组组小小鼠鼠一一般般情情况况观观察察 每日观察并记录各组小鼠体重、饮食、皮毛色泽、情绪、活动量、日常行为及排泄物状态等情况的变化。各各组组小小鼠鼠血血清清中中 、含含量量 酶联免疫吸附法（），参考试剂盒说明书操作。杜杜仲仲雄雄花花对对卵卵巢巢功功能能减减退退小小鼠鼠的的作作用用 卵卵巢巢功功能能减减退退小小鼠鼠造造模模、分分组组、给给药药 雌性昆明小鼠适应性喂养 天后，进行阴道脱落上皮细胞涂片检查，观察小鼠动情周期，筛选 只动情周期正常的小鼠纳入后期实验，按体重随机分为正常组、模型组、杜仲雄花高、低剂量组和戊酸雌二醇组，各组均 只。参考文献方法，除正常组外，其他各组实验第 天以环磷酰胺 （）的负荷剂量行首次腹腔注射，随后以 （）的剂量持续注射 天，后改为一周注射 次，直至实验结束。正常组给予同体积生理盐水进行腹腔注射。于实验第 天开始，持续 天，行阴道脱落上皮细胞涂片检查，判断模型是否成功。于实验进行第 天开始给药，杜仲雄花高、低剂量组分别灌胃给予杜仲雄花醇提物 （）和 （），戊酸雌二醇组灌胃给予戊酸雌二醇悬浊液 （），给药体积均为 。正常组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水。连续给药 天。实验第 天开始，连续 天，阴道脱落细胞学判断动情周期。动动物物取取材材 小鼠最后一次给药后，摘眼球取血，静置后离心，保存，待测雌二醇（）、卵泡刺激素（）水平。颈椎脱臼法处死小鼠，摘取双侧卵巢，称重后置于 甲醛中固定，待组织病理检测。计算卵巢脏器指数。检检测测指指标标 阴阴道道脱脱落落细细胞胞涂涂片片观观察察动动情情周周期期 每日上午：，用 移液枪吸取 生理盐水，于小鼠阴道内反复抽吸 次，将抽吸的液体滴于载玻片上，摊涂均匀。待涂片自然干燥后，滴加瑞氏液染色固后光镜下观察。连续 天阴道脱落细胞涂片观察判断动情周期。血血清清中中 、水水平平 酶联免疫吸附法（），参考试剂盒说明书操作。组组织织病病理理学学检检测测（染染色色）将所取小鼠卵巢组织进行脱水与透明。浸蜡、包埋、切片。用苏木精染色数分钟后，自来水洗涤。放入 盐酸酒精分色约 后水洗，最后伊红染色液中染色，自来水冲洗。封片，光镜下观察切片。统统计计学学分分析析 各实验数据结果均以?来表示。采用统计软件 进行实验数据的统计学处理分析，多组数据之间进行单因素方差分析，若正态不齐，则选用非参数检验中的两个独立样本进行两两比较分析。表示差异有统计学意义。结果 阴阴虚虚证证、阳阳虚虚证证模模型型各各组组小小鼠鼠一一般般状状态态 阴虚证：正常组各小鼠饮食正常，生长状态良好，皮毛致密光滑，二便正常。模型组小鼠均出现活动量增大，精神状态活跃，喜动，易咬人，皮毛较正常组稍潮红，呈竖立状态，大便量少且干结。阳虚证：正常组小鼠各项生理状态及机能均正常。模型组小鼠表现出体毛暗淡无光泽，肢体蜷缩，易出现肢体发冷打颤，喜团卧，饲养笼垫料易湿，大便频繁且稀溏。阴阴虚虚证证、阳阳虚虚证证模模型型各各组组小小鼠鼠体体重重及及脏脏器器指指数数 阴阴虚虚证证小小鼠鼠体体重重及及脾脾脏脏脏脏器器指指数数 由表 可见，与正常组比较，模型组体重和脾脏指数均减小（或 ）；与模型组比较，杜仲雄花高剂量组体重和脾脏指数均提高（）。表 杜仲雄花对阴虚小鼠体重及脾脏脏器指数的影响（?）组别体重 实验第 天实验第 天脾脏指数 正常组 模型组 雄花低剂量组 雄花高剂量组 与正常组比较，；与模型组比较，；阳阳虚虚证证小小鼠鼠体体重重变变化化及及脾脾脏脏、肾肾脏脏脏脏器器指指数数 从表 可见：与正常组相比，造模后实验第 天，造模小鼠体重较小（）；给药后，与模型组相比，杜仲雄花低剂量组脾脏指数增加，杜仲雄花高剂量组体重、脾脏和肾脏指数均明显提高（均为 ）。表 杜仲雄花对阳虚小鼠体重及脾脏、肾脏脏器指数的影响（?）组别体重 实验第 天实验第 天实验第 天脾脏指数 肾脏指数 正常组 模型组 雄花低剂量组 雄花高剂量组 与正常组比较，；与模型组比较，；阴阴虚虚证证、阳阳虚虚证证模模型型各各组组小小鼠鼠血血清清中中 、水水平平 图、图 结果显示：与正常组相比，阴虚证模型组 水平升高，水平降低，比值升高（或 ）；与模型组相比，杜仲雄花可升高 水平和 比值（）。图、图 结果显示：与正常组相比，阳虚证模型组 水平降低（），水平升高，比值降低（）；与模型组相比，雄花高、低剂量组均可升高，降低 水平（或 ），雄花高剂量组还可升高 比值（）。卵卵巢巢功功能能减减退退模模型型各各组组小小鼠鼠动动情情周周期期的的变变化化 实验第 天阴道脱落上皮细胞涂片显示，各组小鼠造模前的动情周期均表现正常。实验进行第 天开始进行阴道脱落上皮细胞的涂片光镜观察，持续 天，发现造模小鼠动情周期紊乱，出现动情期的缩短或者消失，动情间期阴道内分泌物大量增多，可观察到成片或成团的白细胞，同时在动情周期紊乱期间，还观察到小鼠处于动情间期的持续时间较正常动情周期延长。与正常组比较，；与模型组比较，图 杜仲雄花对阴虚证小鼠血清、的影响（?）时珍国医国药 年第 卷第 期 与正常组比较，；与模型组比较，图 杜仲雄花对阳虚证小鼠血清、的影响（?）与正常组比较，；与模型组比较，图 杜仲雄花对阴虚证及阳虚证小鼠血清 的影响（?）于实验第 天进行各组小鼠细胞涂片，持续 天。与模型组比较，给药组均出现动情周期的恢复：观察到正常的动情期、动情间期缩短、涂片内白细胞减少等。卵卵巢巢功功能能减减退退模模型型各各组组小小鼠鼠体体重重及及卵卵巢巢、胸胸腺腺和和脾脾脏脏脏脏器器指指数数 图 显示：与正常组比较，模型组卵巢指数、胸腺指数、脾脏指数均下降（）；与模型组相比，雄花高、低剂量组胸腺指数、脾脏指数增加，雄花高剂量组卵巢指数增加（或 ）。图 杜仲雄花对卵巢功能减退小鼠卵巢、胸腺及脾脏脏器指数的影响（?）卵卵巢巢功功能能减减退退模模型型各各组组小小鼠鼠血血清清中中 、水水平平 表 结果显示：与正常组比较，模型组小鼠血清 水平降低、含量升高（）；与模型组比较，雄花高剂量组血清中 水平升高，水平降低（）。表 杜仲雄花对卵巢功能减退小鼠血清、水平的影响（?）组别 正常组 模型组 雄花低剂量组 雄花高剂量组 雌二醇组 与正常组比较，；与模型组比较，；各各组组动动物物卵卵巢巢病病理理切切片片 如图 所示：染色后光学显微镜下观察，各级卵泡形态和结构均完整，卵泡颗粒细胞层丰富，髓质充盈；与正常组比较，模型组可见卵巢萎缩，各级卵泡数显著减少，卵泡颗粒细胞层减少；杜仲雄花低剂量组成熟卵泡有所减少，但未见明显卵巢萎缩；杜仲雄花高剂量及雌二醇组各级卵泡数量基本正常或略有减少，未见明显卵巢萎缩。正常组；模型组；杜仲雄花低剂量组；杜仲雄花高剂量组；雌二醇组图 各组小鼠卵巢病