碱性成纤维细胞生长因子联合...碱烧伤大鼠角膜纤维化的作用_何冰冰.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）碱性成纤维细胞生长因子联合多西环素对碱烧伤大鼠角膜纤维化的作用*何冰冰，邹文进（广西医科大学第一附属医院，南宁530021）摘要目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单独或联合多西环素对预防角膜碱烧伤纤维化形成的作用。方法：取健康SD雄性大鼠，随机分为对照组、bFGF组、多西环素组、多西环素+bFGF组，每组15只，均制备左眼角膜碱烧伤模型，建模后连续给药14 d。进行角膜混浊程度评分，苏木精伊红（HE）染色观察角膜组织病理形态改变，分别采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和免疫荧光法检测平滑肌肌动蛋白（-SMA）、波形蛋白（Vimentin）和型胶原（Col）基因和蛋白表达。结果：bF-GF组、多西环素组、bFGF+多西环素组角膜混浊度评分及Col、-SMA和Vimentin mRNA及蛋白表达水平均低于对照组（均P0.05）。bFGF+多西环素组-SMA mRNA相对表达量及Vimentin荧光染色阳性面积百分比均低于bFGF组和多西环素组，Vimentin mRNA相对表达量低于bFGF组（均P0.05）。与bFGF组、多西环素组比较，bFGF+多西环素组角膜上皮粗糙和基质水肿减轻，胶原排列整齐，炎症细胞和新生血管数量减少。结论：bFGF联合多西环素能够促进碱烧伤大鼠角膜上皮修复，改善胶原结构，抑制角膜纤维化形成，减轻角膜混浊程度。关键词角膜纤维化；碱烧伤；碱性成纤维细胞生长因子；多西环素中图分类号：R779.12文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）12-1958-06DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2022.12.014Effects of basic fibroblast growth factor combined with doxycycline on corneal fibrosis in alkali burn ratsHe Bingbing,Zou Wenjin.(The FirstAffiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)AbstractObjective:To study the effects of basic fibroblast growth factor(bFGF)alone or in combination withdoxycycline on the prevention of corneal alkali burn fibrosis.Methods:Healthy SD male rats were randomly di-vided into control group,bFGF group,doxycycline group and doxycycline+bFGF group,with 15 rats in eachgroup,and the corneal alkali burn models of the left eyes were prepared in the groups.The drug was continuouslyadministered for 14 days after the modeling.Corneal opacity was scored,and the pathological changes of cornealtissues were observed by hematoxylin-eosin(HE)staining.The gene and protein expressions of-smooth muscleactin(-SMA),Vimentin and type collagen(Col)were detected respectively by real-time fluorescence quan-titative polymerase chain reaction(RT-qPCR)and immunofluorescence staining.Results:Corneal opacity score,mRNA and protein expressions of Col,-SMA and Vimentin in bFGF group,doxycycline group and bFGF+doxycycline group were lower than those in control group(all P0.05).The relative expression of-SMAmRNAand the percentage of Vimentin fluorescence staining positive area in bFGF+doxycycline group were low-er than those in bFGF and doxycycline group,and the relative expression of Vimentin mRNA was lower than thatin bFGF group(all P0.05).Compared with bFGF group and doxycycline group,the corneal epithelium rough-ness and stromal edema were reduced,collagen was arranged neatly,and the number of inflammatory cells andneovasculogenesis was reduced in bFGF+doxycycline group.Conclusion:bFGF combined with doxycyclinecan promote corneal epithelial repair,improve collagen structure,inhibit the formation of corneal fibrosis and re-duce the degree of corneal opacity in alkali burn rats.Keywordscorneal fibrosis;alkali burn;basic fibro-blast growth factor;doxycycline*基金项目：广西重点研发项目（No.桂科AB20238003）通信作者，E-mail：big-收稿日期：2022-10-16 1958碱损伤是对眼睛最具破坏性并且最难处理的损伤之一，角膜伤口愈合反应及失调的慢性炎症状态可引起纤维化，导致角膜混浊，造成永久性视力障碍1-2。目前眼表碱损伤的治疗策略主要针对急性期促进上皮愈合、抑制炎症和组织破坏3。重组人表皮生长因子（rhEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为两种基因工程新药已经成功应用于眼表创伤、烧伤患者的治疗4。bFGF能更快地重建完整的多层上皮，调节角膜创面愈合5，还能抑制皮肤瘢痕的形成6-7。多西环素为四环素类抗生素，具有强大的抗炎作用，能够改善早期的炎症反应8，降低心脏9、肺10等组织的纤维化，减少瘢痕厚度，并改善胶原蛋白结构11。探索早期有效的治疗方案，促进角膜伤口愈合、减轻炎症反应、减少新生血管形成及角膜瘢痕形成对于碱烧伤后恢复角膜上皮完整性及透明度具有重要意义12。本研究通过复制大鼠角膜碱烧伤模型，观察bFGF与多西环素联合应用对角膜碱烧伤引起的组织纤维化的抑制作用。1材料与方法1.1主要试剂bFGF 冻干粉购自 Cloud-clone 公司；多西环素粉末购自Sigma公司；抗波形蛋白（Vi-mentin）抗体购自Abcam公司；苏木精伊红（HE）染色液、抗型胶原（Col）抗体、抗平滑肌肌动蛋白（-SMA）抗体、CY3标记羊抗兔IgG均购自武汉赛维尔公司；羊抗兔IgG H&L购自武汉三鹰公司；含DAPI的抗荧光淬灭封片液购自北京索莱宝公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测试剂盒均购自 Takara 公司；异氟烷购自瑞沃德公司。1.2实验动物与分组健康雄性SD大鼠60只，体重180220 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK桂2020-0003，动物使用许可证号：SYXK桂2020-0004。实验前所有大鼠均通过裂隙灯排查眼前节疾病。将大鼠随机分为对照组、bFGF组、多西环素组、bFGF+多西环素组，每组15只。本研究实验方案经广西医科大学实验动物伦理委员会批准（批准号：202107008）。1.3碱烧伤大鼠模型的建立及分组处理用异氟烷对大鼠进行全身麻醉，盐酸丙美卡因滴眼液滴左眼进行表面麻醉，移液枪吸取2 L 1 mol/L NaOH溶液，滴到3 mm直径的滤纸上，置于角膜中央40 s后移去，使用25 mL生理盐水彻底冲洗眼表。冲洗完成后，角膜中央形成磨玻璃状的圆形灰白色烧灼斑，角膜基质水肿，虹膜隐约可见，即为造模成功2,13。造模成功后，对照组以 PBS 溶液滴眼，bFGF组、多西环素组分别以10 g/L bFGF、1.0 g/L多西环素滴眼，bFGF+多西环素组先使用10 g/L bFGF滴眼，后用1.0 g/L多西环素滴眼（bFGF和多西环素均溶解于PBS中），每4 h滴1次，4次/d，20 L/次，连续14 d。1.4角膜浑浊程度评分14 d后深度麻醉下处死各组大鼠，用裂隙灯显微镜观察各组大鼠角膜混浊程度并评分。评分标准14：（1）0分：角膜透明无混浊；（2）1分：角膜轻度混浊，虹膜纹理可见；（3）2分：角膜混浊较重，虹膜纹理不清；（4）3分：角膜混浊进一步加重，但可见瞳孔；（5）4分：角膜完全混浊，看不清瞳孔。1.5大鼠角膜HE染色各组随机取5只大鼠，摘取左眼球，剪取角膜，置于4%多聚甲醛中固定 24 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 m厚连续切片，行HE染色，中性树胶封片，于光学显微镜下观察角膜组织病理学改变。1.6RT-qPCR 法检测-SMA、Vimentin 和 Col mRNA表达提取大鼠角膜组织总RNA，逆转录成cDNA，行PCR扩增。PCR反应条件：95 预变性30 s；95 变性3 s，60 退火、延伸30 s，共40个循环。引物由武汉赛维尔公司设计并合成，序列如下：GAPDH上游：5-CTGGAGAAACCTGCCAAG-TATG-3，下游：5-GGTGGAAGAATGGGAGTT-GCT-3；-SMA上游：5-ACCATCGGGAATGAAC-GCTT-3，下游：5-CTGTCAGCAATGCCTGGGT-AT-3；Vimentin 上游：5-CGCCAGATGCGTGAA-ATG-3，下游：5-CCAGAGGAAGTGACTCCAG-GTTA-3；Col 上游：5-AATATGTCCACAGCC-TTCTACACC-3，下游：5-ACCCATTCCTCCGAC-TCCA-3。采用2-CT法计算目的基因相对表达量。1.7免疫荧光法检测-SMA、Vimentin和Col 蛋白表达取角膜组织石蜡切片，抗原修复后用0.5%Triton进行通透，5%BSA封闭30 min；加入抗Vimentin（1 200）、抗Col （1 200）、抗-SMA（1 200）抗体4 孵育过夜，加入荧光二抗488羊抗兔IgG H&L（1 500）或CY3标记羊抗兔IgG（1 500）避光室温孵育50 min，再加入含DAPI的抗荧光猝灭剂后封片。荧光显微镜（EVOS FLAUTO）下随机选何冰冰,等.碱性成纤维细胞生长因子联合多西环素对碱烧伤大鼠角膜纤维化的作用 1959广西医科大学学报2022 Dec；39（12）取3个视野