基于响应面法的花豇豆酯酶提取工艺_马月琼.pdf

食品工业 2023 年第44卷第 2 期 28 工艺技术基于响应面法的花豇豆酯酶提取工艺马月琼，陈守慧*，魏新林*上海交通大学农业与生物学院，上海食品安全工程技术研究中心（上海 200240）摘要基于酶抑制原理建立果蔬中农药残留的快速检测方法,以固蓝B盐作为显色剂,通过比较面粉、麦麸和13种植物种子的总酯酶活力和比活力,确定用于农药残留检测的最佳植物酯酶源。结果表明,花豇豆酯酶的总酯酶活力和比活力最大,确定花豇豆为最佳植物酶源。结合单因素试验、响应面试验和验证试验确定植物酯酶最佳提取条件:料液比15(g/mL)、提取液pH 8、浸提时间2 h、离心速率8 000 r/min,此最佳提取条件下酶活力为9.081 U/mL。因此,在该条件下能够较好地从花豇豆中提取植物酯酶,并且能够保持较高的酶活力。关键词植物酯酶;筛选;提取优化;响应面分析Extraction Technology of Cowpea Esterase Based on Response Surface MethodologyMA Yueqiong,CHEN Shouhui*,WEI Xinlin*School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai Food Safety Engineering Technology Research Center(Shanghai 200240)Abstract Based on the principle of enzyme inhibition,a rapid detection method for pesticide residues in fruits and vegetables was established.Using fast blue B salt as a color developing agent,by comparing the total esterase activity and specific activity of flour,wheat bran and 13 plant seeds,the best plant esterase source for pesticide residue detection was determined.The results showed that the total esterase activity and specific activity of cowpea esterase were the largest,and cowpea was determined as the best plant enzyme source.Combined with single factor experiment,response surface experiment and verification experiment,the optimum extraction conditions of plant esterase were determined as follows:the ratio of material to liquid was 15(g/mL),the pH of the extract was 8,the extraction time was 2 h,and the centrifugal rate was 8 000 r/min.Under this optimum extraction condition,the enzyme activity was 9.081 U/mL.Therefore,under these conditions,plant esterases could be better extracted from cowpea,and high enzyme activity could be maintained.Keywords plant esterase;screening;extraction optimization;response surface analysis联合国预测，到2050年全球人口可达到92亿。随着人口密度的增加，食物的需求也在不断地增加。因此，对于提高作物及农产品的产量，需要引起全世界的重点关注，粮食产量增加的前提是农业的大力发展。农药是保护农作物产量和质量最重要的工具。在世界范围内，我国是最大的农药产地，其使用量位居首位，每年产量可达50多万 t，农药的种类约1 100种1，全球每年使用的化学农药约300万 t2。有研究表明，在全球范围内的农作物种植过程中，若不使用农药，全球农作物总产量损失的10%40%是由病虫害造成的3。农药是一把双刃剑：一方面，农药的使用具有防治病虫害、使农作物稳产和高产、增加农民收入的好处；另一方面，在农业生产中，农药残留是使用农药后必不可少的一种现象，亦是不能忽视的重要问题。农药是有毒、易残留的化学物质，大部分具有稳定性较高、半衰期长4的特点。国家及相关部门虽然对农药进行管控，但事实上执行力度尚且不够，对于农药的过分依赖或者不合理使用导致农产品中农药残性子多糖提取工艺J.中成药,2011,33(7):4.26 SPIGNO G,DE FAVERI D M.Microwave-assisted extraction of tea phenols:A phenomenological studyJ.Journal of Food Engineering,2009,93(2):210-217.27 李文佳,汪安琪,施瑞城,等.基于聚乙二醇/水体系的菠萝蜜果皮多糖提取及其抗氧化活性研究J.食品工业科技,2018,39(22):150-157.28 严汉彬,韩珍,徐艳,等.超声波辅助酶法提取百香果果皮中果胶的工艺研究J.中国食品添加剂,2021,32(6):4.29 谢鹏,高愿军,秦令祥,等.表面活性剂协同双频超声波辅助提取香菇多糖工艺及抗氧化活性研究J.食品研究与开发,2021,42(21):56-61.30 钱春强,林文飞,吴德平,等.碱提法提取大球盖菇多糖工艺及其清除氧自由基研究J.现代食品,2021(3):99-102.31 马淑凤,王利强,胡志超,等.酶法提取白灵菇深层发酵菌丝体多糖的研究J.农业工程学报,2006,22(9):198-201.29 工艺技术 食品工业 2023 年第44卷第 2 期留问题极其严重，自然环境也会受到严重污染，与此同时对人体健康和生态环境均带来极大的危害5。据报道，在每年各省市场监督管理局发布的食品抽检报告中，其不合格食品涉及的问题主要包括农兽药残留超标、食品添加剂超标、微生物污染和重金属超标。其他国家也会因我国食品的农药残留超标问题选择拒绝进口并召回含农残的食品。酶抑制法根据酶源的不同可分为动物酯酶抑制法和植物酯酶抑制法。动物酯酶一般来源于动物的脑组织和血液中6-7。而植物酯酶广泛存在于各种作物中，包括小麦、玉米和不同豆类作物等。与动物酯酶相比，植物酯酶具有来源丰富、取材方便、提取步骤简单快捷、成本低、易于保存等优势，因此自20世纪80年代以来，研究者开始逐渐地用植物酯酶代替动物酯酶。试验以总酯酶活力和比活力为考核指标，对面粉、麦麸和13种植物种子中提取的植物酯酶进行筛选，选取适宜的植物酶源，并采用单因素试验和响应面试验结合的方法对植物酯酶的提取条件进行优化，为植物酯酶的有效提取和深入研究花豇豆酯酶用于农药残留的检测提供参考，为寻求新的植物酯酶源提供依据。1材料与方法1.1材料与试剂小麦面粉、小麦（普洱市思茅区魏晓兰百货店）；玉米、红芸豆、花豇豆、麦麸、黑小麦、小麦仁、生白芝麻、荞麦、蚕豆、绿豆、青豌豆、大黑豆、扁豆（河南省虞城县兴艺商贸有限公司）；-乙酸萘酯、-萘酚、固蓝B盐、十二烷基磺酸钠（SDS）、丙酮（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；牛血清蛋白（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）。1.2仪器与设备TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Dynamica高速冷冻离心机（上海驭锘实业有限公司）；HWS-26电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；524G恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；ST5000实验室pH计（常州奥豪斯仪器有限公司）；BSA3202S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。1.3方法1.3.1植物酯酶粗酶液的制备将植物种子清洗干净，晒干后粉碎3次后备用。准确称取一定量的样品加入到250 mL锥形瓶中，按15（g/mL）的料液比加入0.1 mol/L pH 6.4的磷酸盐缓冲液，混合均匀后，在恒温磁力搅拌器上充分振荡1 h，经4层纱布过滤，将滤液倒入离心管，放于冷冻离心机中，在4 条件下以8 000 r/min的速率离心10 min，收集上清液即为植物酯酶粗酶液，置于-4 下保存备用。1.3.2试验方法1.3.2.1-萘酚标准曲线的制作8配制浓度1 mmol/L的-萘酚无水乙醇标准溶液，取8支试管，用移液枪分别准确吸取0，10，20，30，40，50，60和70 L的-萘酚无水乙醇标准溶液于试管中，依次加入0.1 mol/L pH 6.4的磷酸盐缓冲液至3 mL，混合均匀，分别加入0.5 mL固蓝B盐溶液，再次充分混合后放于30 恒温水浴锅中保温10 min，取200 L于96孔板中，在595 nm处测定吸光度（A595），以不加-萘酚的溶液作空白，每组试验重复3次。以-萘酚标准溶液浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），作图可得最佳标准曲线，建立回归方程，该标准曲线的斜率按式（1）计算。K=/n （1）)(AiCini=1式中：K为-萘酚标准曲线的斜率；Ai为反应液在595 nm处的吸光度（A）；Ci为-萘酚溶液浓度；n为-萘酚标准曲线的浓度点数。1.3.2.2总酯酶活力的测定9取10 mL试管，依次加入1.950 mL浓度0.04 mol/L、pH 6.4磷酸盐缓冲溶液、50 L浓度16 mmol/L的-乙酸萘酯丙酮溶液和0.5 mL稀释一定倍数后的酶液，充分振荡使试管内的溶液混合均匀，将试管放入30 恒温水浴锅中，开始计时，反应15 min后取出试管，加入0.5 mL固蓝B 盐溶液于试管中，振荡混匀后放入30 恒温水浴锅中，开始计时，10 min后取出试管，用移液枪吸取200 L于96孔板中，采用紫外可见分光光度计，在波长595 nm处测其溶液的吸光度，每组试验重复3次。用磷酸盐缓冲溶液作对照，根据式（2）计算总酯酶活力。E=DA595KV0/（TV1）106 （2）式中：E为每毫升酶液的总酯酶活力，U/mL；D为酶液的稀释倍数；K为-萘酚标准曲线的斜率；A595为波长在595 nm处的吸光度；V0为体系的终体积，mL；T表示反应时间，min；V1为所用酶液的体积，mL；U为酶活力单位，1 U表示在一定条件下，每分钟分解得到1 mol-萘酚所需要的酶量。1.3.2.3蛋白含量的测定标准曲线的制作：选用牛血清蛋白作为标准蛋白，绘制标准曲线，参照Bradford10的考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。使用牛血清蛋白配制质量浓度100 g/mL的蛋白标准溶液，0，20，40，60和80 g/mL的蛋白标准溶液可用100 g/mL的蛋白标准溶*通信作者；基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目：崇明芦笋质量安全控制技术研究及示范应用（农产品安全）（2019-02-08-00-02-F01146）食品工业 2023 年第44卷第 2 期 30 工艺技术液直接稀释即可，取6支试管，每支试管加入0.1 mL BSA溶液和1 mL考马斯亮蓝G-250后，充分振荡，在常温条件下反应35 min后，取200 L于96孔板中，在595 nm处测定吸光度A59