碱度长期胁迫对花鲈肾组织转录组的影响_王龙斌.pdf

第 卷第期 年月中 国 海 洋 大 学 学 报 （）：，碱度长期胁迫对花鲈肾组织转录组的影响*王龙斌，泮淼军，王明阳，王润泽，李丽，董双林，李卫东，田相利，*（海水养殖教育部重点实验室（中国海洋大学），山东 青岛 ；青岛海洋科学与技术试点国家实验室，山东 青岛 ；唐山海都水产食品有限公司，河北 唐山 ）摘要：为了解花鲈（）的耐碱机制，本研究探讨了碱度长期胁迫对花鲈肾组织转录组的影响。研究设计了个碳酸盐碱度梯度（、和 ），基于 高通量测序平台进行了花鲈肾组织转录组测序并进行了生物信息学分析。研究表明，组（）、组（）和 组（）分别获得了 、和 条 。与 组相比，组和 组分别有 和 个差异表达基因上调，和 个差异表达基因下调。随机选取条差异表达基因进行实时荧光定量 验证，结果与转录组测序一致，表明本研究中 结果具有较高的可靠性。富集分析发现，差异基因显著富集在气体运输、酶活性的正调控和水解酶活性的正调控等方面；通路富集分析表明，差异基因显著富集在细胞周期、复制和癌症中的蛋白多糖等方面。本研究发现了 个持续变化基因（、和 等），这些基因主要集中在机体生长、能量代谢、免疫反应等功能群中。中、高碱度长期胁迫对花鲈肾组织影响不同，其中，中碱度主要影响肾组织脂肪酸与氨基酸的合成与代谢，而高碱度则主要抑制了细胞有丝分裂和机体免疫能力。研究结果显示，花鲈对碱度的适应是一个涉及多基因的复杂过程，随着碱度升高，花鲈生长受到显著抑制，机体能量代谢增强，免疫能力显著下降。关键词：碱度胁迫；花鲈；肾组织；富集；通路；响应基因中图法分类号：文献标志码：文章编号：（）：引用格式：王龙斌，泮淼军，王明阳，等 碱度长期胁迫对花鲈肾组织转录组的影响 中国海洋大学学报（自然科学版），（）：，（）：*基金项目：国家重点研究发展计划项目（）；中国海洋大学塔里木大学科研联合基金项目（）资助 （）；（）收稿日期：；修订日期：作者简介：王龙斌（），男，硕士生，主要从事水产养殖生态学研究。：*通讯作者：新疆是中国盐碱化土壤分布面积较广、土壤积盐较重的地区，其中南疆盐碱水具有碱度高、离子比例不平衡、水质变动大等特点，合理有效地开发利用盐碱地已成为该地区紧迫而艰巨的任务。碱性水通常具有较高的碱度和，严重影响水生动物的正常生理过程，例如直接抑制鱼类的氨排泄并增加 排泄。尽管如此，仍有一些鱼类可以在高碱的环境中生存，如肯尼亚马加迪湖的马加迪罗非鱼（）、美国金字塔湖的美洲鲑（）、我 国 达 里 湖 的 瓦 氏 雅 罗 鱼（）以及青海湖的裸鲤（）等。这些鱼类已经进化出特殊的生理机制以适应碱性环境。转录组分析是解释功能基因组学元素和揭示细胞与组织分子机制的有力工具之一。近年来，测序技术（）已广泛应用于基因表达谱的研究，包括水生动物响应盐碱胁迫的通路研究。如马加迪罗非鱼、瓦 氏雅 罗 鱼，、尼 罗 罗 非 鱼（）、奥尼罗非鱼（.）等，这些研究提供了大量与碱度胁迫相关的候选通路和基因。花鲈（）属 鲈 形 目（）鮨科（）花鲈属（），具有生长快、病害少、对盐度适应广等特点。近年来，关于花鲈对盐度的适应能力 以及耐受机制 已得到了很好的研究。花鲈对碱度有较高的耐受性，在盐度为 时，碱度 半致死浓度为 。但目前国内外对于花鲈耐碱机制的研究很少，仅见于碱度胁迫下 基因家族 和热休克蛋白（）超家族 的相关研究。期王龙斌，等：碱度长期胁迫对花鲈肾组织转录组的影响在本研究中，我们利用 技术探究了不同碱度下花鲈肾组织的基因表达情况，对其响应碱度胁迫相关的通路及基因进行了综合分析，为了解花鲈适应碱性环境的分子生物学机制提供有价值的信息。材料与方法样本来源及实验设计实验所用花鲈是由唐山由海都水产食品有限公司（河北，唐山）提供的人工繁育苗种。暂养一周后随机选取 尾健康、个体大小均匀的花鲈进行养殖实验。本研究参照南疆阿拉尔地区盐碱水的盐度水平（左右），通过添加 ，设计了不同的碱度梯度。将天然海水与淡水混合成盐度为 的海水，再添加 （分析纯），全部溶解并稳定 后使用。根据前期急性胁迫的结果，设置了 （组）、（组）和 （组）的碱度梯度，具体实测碱度如表所示。每组设置个重复，每个重复 尾鱼，实验鱼体长（），体质量（），实验时间为 年月 日至 月 日，实验周期为。表碳酸盐碱度设置 碱度项目 处理组 碱度预设值 碱度实测值 实验所用水体的体积为 ，盐度为，水温控制在（），溶氧（），。实验期间，每天：和：各投喂花鲈专用颗粒饲料次，投喂量约为鱼体质量左右，每天换水，并检测碳酸盐碱度和。以 型精密 计测定，碳酸 盐 碱 度 以 酸 碱 滴 定 法（）测定。生长指标的测定实验开始和结束时测量花鲈的体质量，按以下公式计算体质量特定生长率（）：（）。式中：为初始体质量（）；为终末体质量；为实验时间（）。实验数据以平均值标准差表示，实验结果采用 软件对实验数据进行统计分析。先对数据做单因素方差分析，组间若有显著性差异，再用 多重比较分析，时认为有显著差异。提取、建库和测序实验结束时，每个处理随机取尾鱼（共尾）使用 麻醉，解剖以获得肾组织，在液氮中速冻并储存在 用于 分离。使用 公司的 试 剂 盒 提 取 组 织 ，然 后 使 用 公司 的 去 除 基 因 组 污 染，采 用 、和 方法检测 样品纯度、浓度和完整性，检验合格的样品送上海美吉生物医药科技有限公司，采用 方法进行文库构建，基于 测序平台以 双末端测序模式分别对个样本进行转录组测序。序列比对利用 对测序获得的原始数据进行质量评估，然 后 用 （：）和 （：）去除测序接头序列、低质量读段、率较高序列及长度过短序列。通过 将质控后的数据与花鲈参考基因组（：）进行比对，获得用于后续分析的 。表达量差异分析使用 对 进行计数，然后通过 进行数据标准化。利用 包 筛 选 差 异 表 达 基 因，将 且 作为筛选标准。将花鲈肾组织在三个处理下两两对比得到的基因集（，）中进行比较分析。富集和 通路富集分析使用 软 件 （：）对差异基因进行 富集分析，采用 方法对值进行校正，当经过校正的值（）小于 时，认为此 功能存在显著富集。利用 软件（）对差异基因进行 通路富集分析，以判定差异基因主要影响的生物学功能和通路。验证选择个差异表达基因，使用 软件 设计引物（见表），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，进行实时荧光定量 验证。使用诺唯赞公司 试剂盒将总 逆转录合成 ，中国海洋大学学报 年再以逆转录产物为模板、以 为内参基因，使用诺唯赞公司的 试剂盒，在 型荧光定量 仪上进行表达量分析。总体系 的反应体系 如 下：稀 释 倍 的 模 板 ，正反向引物各 ，。反应程序：，个循环。最后在 制作熔解曲线。每组样品的每个基因均重复次，采用 法 分析基因的相对表达量。使用 软件计算 结果和 结果之间的相关性系数。表 引物信息 引物 正向引物（）（）反向引物（）（）结果生长指标养殖实验结果见表。由表可以看出，碱度严重影响花鲈生长，随着碱度升高，花鲈的终末体质量、特定生长率显著降低。在 的中碱度下，花鲈的生长速率显著降低。而在 的高碱度下，花鲈的终末体质量显著低于初始体质量。表不同碱度对花鲈生长性能的影响 处理组 初始体质量 终末体质量 特定生长率 （）注：同一列数字上的不同字母表示差异显著（）。（）测序数据统计与参考序列比对分析所有样品的 浓度均高于 ，总量，均符合建库要求。对个转录组测序结果进行分析可知，所有样品获得的 数量在 之间，利用 软件过滤掉不合格的序列后，所有样品得到的有效读数均占原始读数总数量的 以上（见表）。表中，、分别指测序质量在 和 以上的碱基占总碱基的百分比，在得到的个转录组中，均在 以上，均在 以上。利用 软件将有效读数比对到参考基因组，结果发现有 读数成功映射到参考基因组。这些结果表明，花鲈肾组织各处理组测序量大，获得的有效读数数量多，转录组质量高，符合进一步生物信息学分析的要求。表达量差异分析使用 基 于 负 二 项 分 布 的 软 件 对 进行分析，基于一定的标准化处理和筛选条件获得比较组间表达差异的基因，参数如下：。分析得到的差异表达基因结果表明，在不同的碱度环境下，花鲈发生显著差异表达基因的数量也不同（见表）。与 组相比，组期王龙斌，等：碱度长期胁迫对花鲈肾组织转录组的影响表花鲈肾组织转录组高通量测序基本数据统计 样品 原始读数 有效读数 含量 总比对 多个位点比对 专一位点比对 （）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）有 个基因上调，个基因下调；组有 个基因上调，个基因下调；与 相比，组有 个基因上调，个基因下调。对不同碱度下差异表达基因进行综合分析，结果如图所示，与 组相比，组与 组分别有 和 个特有的差异表达基因；与 组相比，组有 个特有的差异表达基因；个基因集共有的差异表达基因为 个。表花鲈肾组织差异表达基因统计结果 总计 上调 下调 总计 和 富集分析为确定可能参与碱度胁迫的生物过程或通路，分别对 个 基 因 集（，）中 的 显 著 差 异 基 因 进 行 和 富集分析。富集结果显示，差异基因被富集到生物过程、细胞组分和分子功能个类别体系中。其中最丰富的类别是生物过程，其次是分子功能和细胞组分。图显示了肾中个基因集前 个显著 术语。可以看图花鲈肾组织 组、组和 组显著差异表达基因的维恩图 ，中国海洋大学学报 年图花鲈肾组织 （）、（）和 （）组差异表达基因的富集分析 （），（）（）期王龙斌，等：碱度长期胁迫对花鲈肾组织转录组的影响出，中气体运输、氧结合、血红蛋白复合物富集程度最高，中水解酶活性的正调控、活性的正调控、活性的调节富集程度最高，而 中 复制启动、蛋白质磷酸化、丝氨酸家族氨基酸代谢过程富集程度最高。其中，活性的正调控、水解酶活性的正调控、水解酶活性的调节、活性的调节、丝氨酸家族氨基酸代谢过程、氨基酸代谢过程、细胞氨基酸代谢过程等在 和 中均显著富集。分析表明，在个基因集中，分别有 、条通路与碱度胁迫有关。图显示了肾 和 两个基因集前 个显著 通路。可以看出，中细胞周期、叶酸一碳库、过氧化物酶体显著富集，中 复制、癌症中的蛋白多糖、轴突导向显著富集。其中，细胞周期、复制、叶酸一碳库、上皮细胞的细菌侵袭、趋化因子信号通路、轴突导向、肌动蛋白细胞骨架的调节、错配修复、信号通路和癌症中的蛋白多糖在 和 均显著富集。图花鲈肾组织 （）组和 （）组差异基因 散点图 （）（）花鲈肾组织碱度胁迫响应的关键基因分析图表明 、这个基因集中有 个共有差异基因，这些基因是花鲈肾组织碱度胁迫响应的关键基因，其中大多随着碱度升高而降低（见表）。验证为了确认 结果的准确性和可重复性，选择个代表性基因，通过实时定量 （）验证不同处理组基因的表达水平。进一步将所选基因的相对表达量与 测序结果进行了相关中国海洋大学学报 年性分析（见图）。可以看出，虽然所选基因在表达变化幅度上存在一定差异，但 检测结果与 测 序 结 果 中 基 因 的 表 达 趋 势 基 本 一 致（），这表明了 测序获得的转录组数据以及生物信息学分析的可靠性。讨论作为水生动物的重要器官，鱼类肾脏主要具有维持渗透压和离子平衡的功能，在鱼类的渗透调节过程中 起着重要作用。研究发现，高碱度会使鱼类肾组表花鲈肾组织碱度胁迫响应的关键基因 基因名称 注释 核糖核苷二磷酸还原酶大亚基样 癌胚抗原相关细胞黏附分子样 膜突亚型 蛋白着丝粒 醌氧化还原酶 亚型 原癌基因酪氨酸蛋白激酶 激活蛋白 样亚型 丝裂原活化蛋白激酶激酶 亚型 泛素蛋白连接酶 亚型 .去唾液酸糖蛋白受体样 长链脂肪酸 连接酶亚型 ，半乳糖基转移酶样亚型 溶质载体家族，促进葡萄糖转运蛋白成员样 丙酮酸激酶 样亚型 细胞周期蛋白 低质量蛋白质：淋巴因子激活的杀伤性 细胞源性蛋白激酶 肽基脯氨酰顺反异构酶 细胞周期蛋白 尿苷磷酸化酶 长链脂肪酸 连接酶样 细胞周期素依赖激酶调节亚单位 甘油醛磷酸脱氢酶亚型 特异性二酰甘油脂肪酶 激活蛋白 型受体样亚型 氨基酸氧化酶样 葡萄糖醛酸转移酶 样亚型 嘌