甲氨蝶呤对小鼠磨牙牙胚发育的影响_罗容春.pdf

口腔颌面外科杂志2023年2月 第33卷第1期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol33 No1 February,2023基础研究甲氨蝶呤对小鼠磨牙牙胚发育的影响罗容春，韩雪，王海丞，朱辙文，刘力维，王佐林（上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院，同济大学附属口腔医院口腔种植科，上海200072）摘要目的：探究甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）对磨牙牙胚发育的影响。方法：体外于体式显微镜下分离出胚胎13.5 d（E13.5）小鼠下颌第一磨牙（first molar，M1）牙胚，并将其加入到新鲜的器官培养液中。将MTX溶解于二甲基亚砜，分别配制成0.1、1.0、10.0 mol/L MTX的器官培养液，作为实验组（MTX组）；在培养液中加入等量的二甲基亚砜，作为对照组。隔日拍照观察牙胚变化的情况。对出生后2 d（P2）至出生后6天（P6）的新生鼠按1、3、5 mg/kg的剂量进行腹腔注射MTX（隔日注射），于第2.5、4、6、8天时取样，对下颌第三磨牙（third molar，M3）进行组织学分析。结果：体外培养9 d后，观察到1.0、10.0 mol/L MTX组牙胚均死亡；0.1 mol/L MTX组牙胚的宽度、总高度及牙尖高度均出现异常。体内实验观察到3、5 mg/kg MTX组的P8小鼠下颌M3较对照组形态异常；凋亡检测结果表明，3 mg/kgMTX组下颌M3在牙发育过程中，其凋亡细胞较对照组多；免疫荧光结果表明，在P2.5、P4小鼠下颌M3中，3 mg/kgMTX组增殖细胞较对照组少，P6、P8小鼠下颌M3中，3 mg/kg MTX组增殖细胞较对照组多。结论：MTX会导致磨牙形态发育异常，出现牙胚体积减小、发育延缓等,这可能是因为牙发育过程中，MTX促进了牙胚细胞凋亡，在蕾状期及帽状期抑制了牙胚细胞增殖。关键词甲氨蝶呤；牙发育；细胞增殖；细胞凋亡中图分类号 R782文献标志码 ADOI:10.3969/j.issn.1005-4979.2023.01.001Effect of methotrexate on the development in mouse molar tooth germLUO Rongchun,HAN Xue,WANG Haicheng,ZHU Zhewen,LIU Liwei,WANG Zuolin(Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration,Department of OralImplantology,School and Hospital of Stomatology,Tongji University,Shanghai 200072,China)Abstract Objective:To explore the effect of methotrexate(MTX)on the development of mouse molar tooth germ.Methods:In vitro,mandibular first molar(M1)tooth germs from the 13.5th day embryonic(E13.5)mouse were dissectedunder stereomicroscope and then cultured with fresh organ culture solution.In the experimental group,MTX was dissolvedinto the dimethyl sulfoxide(DMSO)to prepare organ culture solution containing 0.1,1.0,10.0 mol/L MTX;in the con-trol group,the same volume of DMSO was added to the organ culture solution.And the change of germs was taken pho-tos every other day.In vivo,1,3,5 mg/kg MTX solution was managed intraperitoneally in postnatal mouse every other dayfrom the second postnatal day(P2)to P6,and the mandibular third molars(M3)were histologically evaluated at P2.5,P4,P6,P8.Result:After 9-day in vitro culture,it was observed that tooth germs were all dead in 1.0 mol/L MTXand 10.0 mol/L MTX group,and the tooth germs of 0.1 mol/L MTX showed abnormality in the width,total height andcusp height.In vivo,the morphology of mandibular M3 in 3 mg/kg MTX and 5 mg/kg MTX group showed more abnormali-ties than that in the control group.Apoptosis assay results showed that more apoptotic cells in 3 mg/kg MTX group thanthat in the control group.Immunofluorescent assay results showed the proliferative cells of mandibular M3 from P2.5 andP4 mouse in 3 mg/kg MTX group were less than that in the control group and proliferative cells from P6 and P8 in 3 mg/kgMTX group were more than that in the control group.Conclusion:MTX may cause the abnormalities in morphology devel-接受日期：2022-01-29修回日期：2022-03-14基金项目：国家自然科学基金（82000995、81670962）；科技部重点研发专项（2018YFE0202200）作者简介：罗容春，住院医师.E-mail:通信作者：王佐林，教授.E-mail:1口腔颌面外科杂志2023年2月 第33卷第1期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol33 No1 February,2023在我国，急性淋巴细胞白血病（acute lym-phoblastic leukemia，ALL）是最常见的儿童恶性肿瘤，发病高峰在25岁，该病治愈率高。随着诊疗方案的改进，该病5年生存率可达85%1-2，化疗产生的长期副作用会导致患者的远期生活质量下降3。联合化疗是儿童ALL常见且有效的治疗方案之一，主要的化疗药物包括环磷酰胺、长春新碱、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤（MTX）、依托泊苷等4。临床研究表明，ALL患儿牙发育异常的比例较正常儿童更高4-7。动物实验研究表明，使用化疗药物可导致牙发育不全、缺牙、牙根短小、牙釉质和牙本质发育缺陷等8-9，其严重程度取决于接受化疗的年龄、化疗药物的类型等6,10-11。牙发育是一个复杂的过程，包含上皮与间充质之间的相互作用、细胞分化、形态发生、组织矿化、牙齿萌出12-13，与机体内外环境紧密相关14。在牙发育过程中，化疗药物可能导致上皮和间充质细胞代谢紊乱，出现增殖分化异常，甚至造成牙齿缺失等。MTX通过抑制二氢叶酸还原酶干扰DNA的合成、修复，特异性抑制S期细胞增殖15-16，同时其具有促进细胞凋亡的作用17-19。ALL患儿化疗后出现牙发育异常，可能是由于用药期间牙胚正处于发育阶段，化疗药物对肿瘤细胞缺乏特异性，也可作用于正处于增殖阶段的健康细胞20。目前，大剂量应用MTX治疗儿童白血病对牙发育的影响尚不明确。本研究旨在探究MTX对磨牙牙胚发育的影响。1材料和方法1.1实验动物实验使用6周龄美国癌症研究所（Institute ofCancer Research，ICR）雌鼠及雄鼠，每晚6点合笼，早上8点检栓，见栓当天记为E0.5，新生鼠出生当天记为P1。所有实验动物均来自斯贝福（北京）生物技术有限公司，该动物实验获同济大学附属口腔医院伦理委员会审查批准批准号：（2019）-DW-06。1.2实验试剂及设备1.2.1实验耗材、试剂器官培养皿（Falcon公司，美国）；器官培养小室（Falcon公司，美国）；DMEM/F-12培养液（Gibco公司，美国）；胎牛血清（Gibco公司，美国）；L-谷氨酰胺（Gibco公司，美国）；青霉素-链霉素（Gibco公司，美国）；二甲基亚砜（上海青牧生物科技公司，中国）；L-抗坏血酸（Sigma公司，美国）；聚乙二醇（MCE公司，美国）；MTX（MCE公司，美国）；吐温80（生工生物工程公司，中国）；0.9%氯化钠溶液（上海长征富民金山制药公司，中国）；苏木精-伊红染色试剂盒（上海威奥生物科技公司，中国）；一步法TUNEL凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术公司，中国）；PCNA抗体（Affinity公司，美国）。器官培养液：DMEM/F-12培养液、20%胎牛血清、180 g/mL L-抗坏血酸、2 mmol/L谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素；体内注射赋形剂：2%二甲基亚砜、30%聚乙二醇、5%吐温80、0.9%氯化钠溶液；腹腔注射用MTX溶液：将MTX溶于赋形剂配制而成。1.2.2实验设备体式显微镜（Zeiss公司，德国）；倒置显微镜（Zeiss公司，德国）；石蜡切片机（Leica公司，德国）；CO2细胞培养箱（Thermo Fisher公司，美国）。1.3实验方法1.3.1体外实验体式显微镜下分离出胚胎13.5 d（E13.5）小鼠下颌第一磨牙（M1）牙胚32只，在5%CO2、37 条件下于细胞培养箱中进行体外培养21，根据白血病患者应用大剂量MTX治疗后的血药浓度设计培养液中MTX的浓度梯度22。将不同浓度的MTX溶解于二甲基亚砜中，再将其加入至新鲜的器官培养液中，分别配置成0.1、1.0、10.0 mol/L含MTX的器官培养液，记作实验组（MTX组）；对照组培养液中加入等量的二甲基亚砜。每3天换液，隔日在倒置显微镜下拍照，记录牙胚形态及生存状态。体外培养9 d后测量牙胚的宽度、总高度及牙尖高度。1.3.2体内实验1.3.2.1MTX注射后小鼠的存活率、体质量及体型变化将48只下颌M3处于蕾状期的P2小鼠分为4组23，实验组分别腹腔注射1、3、5 mg/kg的MTX溶液24-25，对照组注射等量的赋形剂，每2天注射opment of teeth,with decreased volume of tooth germs and delayed development,which may be attributed to MTX promot-ing tooth germ cell apoptosis during the process of tooth development and inhibiting tooth germ cell proliferation at budstage and cap stage.Key