基于脑、肠源性神经营养因子...疗慢性传输型便秘的作用机制_陈娟.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：国家“重大新药创制”科技重大专项（）；国家自然科学基金（）作者简介：陈 娟（），女（汉族），新疆鄯善人，陕西中医药大学基础医学院在读硕士研究生，学士学位，主要从事胃肠病基础研究工作通讯作者简介：梁星琛（），女（汉族），陕西西安人，陕西中医药大学基础医学院讲师，博士学位，主要从事胃肠病基础研究工作基于脑、肠源性神经营养因子探讨硝菔通结方治疗慢性传输型便秘的作用机制陈 娟，闫曙光，周永学，杜林柯，郭斯文，梁星琛（陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳）摘要：目的 研究硝菔通结方对慢性传输型便秘（，）的作用机制。方法 用大黄粉混悬液诱导建立 大鼠 模型，将大鼠随机分为模型组、硝菔通结方组、莫沙必利组，另设不造模大鼠为空白组。各组大鼠按剂量每日灌胃 次，共。空白组、模型组给与同体积纯水干预。苏木素 伊红（，）染色法观察大鼠结肠组织病理情况；染色观察结肠黏液细胞的黏液分泌情况；蛋白免疫印迹法（）检测、的相关蛋白表达量；实时荧光定量聚合酶链式反应（）法检测、表达水平。结果 与空白组比较，模型组大鼠结肠黏膜肿胀，腺体排列杂乱，、含量明显降低（）；与模型组相比硝菔通结方组、的蛋白表达及 水平均显著升高（）；的表达水平也有提升（）。结论 硝菔通结方对 大鼠 与 及其相关蛋白有促进作用。关键词：脑源性神经营养因子；胶质细胞源性营养因子；慢性传输型便秘 标识：中图分类号：；文献标识码：文章编号：（），（，）：（，），（）；，；，（），（），（）；（），：；慢性传输型便秘（）是一种以结肠运动功能减弱为特征的一类顽固性便秘，其主要的临床表现包括大便频率降低，无明显便意以及不能自主排便，具有功能性、原发性及慢性的特点。研究表明 患者的胃肠道动力异常主要是由肠神经系统（，）受损导致的。肠神经胶质细胞（，）在 中含量最多，是胃肠道中感觉神经和交感神经的卫星细胞，能调节胃肠神经的活动，研究表明当小鼠的 受到破坏后，胃肠动力和肠道传输功能均有下降。所分泌的胶质细胞源性神经营养因子（，）能够促进神经元的存活，减少肠上皮细胞的凋亡并且能促进肠上皮细胞的增生，是促进神经元生长、分化及修复最重要的营养因子之一。主要与其受体 结合发挥作用，产生复合物后再与络氨酸激酶受体 结合，组成 信号通路复合体，该复合体可促进神经元存活、分化、神经组细胞的有丝分裂以及神经轴突的生长。脑源性神经营养因子（，）是脑内一种神经营养蛋白，对神经元的生长、分化、增殖起到举足轻重的作用，在肠神经元和肠上皮细胞中亦有大量表达，通过与酪氨酸激酶受体（，）的结合，释放 羟色胺（，）增强肠道蠕动。是胃肠道重要的神经递质，肠腔内刺激信号的传入首先需通过 来传递，对胃肠功能起重要调节作用。中医认为肾司二便，从肾论治是中医治疗便秘的主要辨证论治思想。本次研究以课题组创立的硝菔通结方作为治疗 的 时珍国医国药 年第 卷第 期代表方剂，以莫沙必利作为阳性对照药物。从脑、肠源性神经营养因子探讨硝菔通结方对 的作用机制。材材料料与与仪仪器器 动动物物 清洁级雄性 大鼠 只，体重（），购于成都达硕实验动物有限公司合格证号：（川）。统一饲养于动物房，自由饮水摄食，情况良好。药药物物 造模用大黄购于陕西兴盛德中药饮片有限公司（批号：），硝菔通结方由肉苁蓉，当归，白术，芒硝，鲜莱菔 组成。肉苁蓉、当归、白术、芒硝均购于兴盛德中药饮片有限公司，鲜莱菔购于西咸世纪大道人人乐超市。枸橼酸莫沙必利（成都康弘药业集团股份有限公司，国药准字）。试试剂剂 苏木素 伊红染色液（北京索莱宝），抗原修复液（北京索莱宝），（北京索莱宝），（北京索莱宝），（北京索莱宝），山羊抗小鼠普通二抗（武汉博士德），小鼠源 抗体（荧光 ），山羊抗兔绿色荧光二抗（北京博奥森生物 ），山羊抗小鼠红色荧光二抗（武汉博士德生物），山羊抗兔普通二抗（武汉博士德生物），自发荧光淬灭剂（武汉博士德生物），兔源 抗体（北京博奥森生物 ），兔源 抗体（北京博奥森生物 ），兔源 抗体（北京博奥森生物 ），兔源 抗体（北京博奥森生物 ），兔源 抗体（北京博奥森生物），兔源 抗体（），兔源 抗体（北京博奥森 ），兔源 抗体（北京博奥森 ），兔源 抗体（美国 ），蛋白浓度测定试剂（武汉博士德生物），、上、下游引物（上海生工生物），凝胶配制试剂盒（武汉博士德生物）。仪仪器器 全自动高压灭菌器（日本三洋）；石蜡切片机（德国 ）；超低温冰箱（美国）；研究级正置数码显微镜（德国 ）；包埋机（泰维科技实业有限公司）；全自动酶标仪（美国 ）；生物组织自动脱水机（泰维科技实业有限公司）；生物组织摊片烤片机（泰维科技实业有 限 公 司 型 恒 温）；掌 上 离 心 机（美 国）；低速离心机（湘仪实验室仪器开发有限公司 ）；荧光定量 仪（美国）；紫外分光光度计（美国）。方法 药药液液制制备备 硝菔通结方组取肉苁蓉，当归，白术，芒硝，鲜莱菔。将鲜莱菔切片，加入芒硝，煮至莱菔熟烂，过滤后加入其他药物煎煮 左右，过滤并浓缩至（）。置于 冰箱保存。造造模模及及分分组组 只 大鼠适应性饲养 周后随机取出 只为空白组（），剩余 只为造模组。造模组每日固定时间以大黄粉 灌胃。造模成功后将大鼠随机分为模型组（）、硝菔通结方组（）和莫沙必利组（）。硝菔通结方组每日以 剂量灌胃，莫沙必利组以莫沙必利悬液 灌胃。空白组及模型组大鼠每日纯水 灌胃一次，共给药 天。样样本本采采集集 大鼠禁食不禁水，戊巴比妥钠溶液麻醉。开腹后从肛门位置向上取出整段结肠，冲洗后截取部分结肠组织包埋，置于 多聚甲醛中固定，部分组织 冰箱冻存备用。结结肠肠组组织织的的病病理理观观察察 将 多聚甲醛固定的结肠组织梯度乙醇脱水，石蜡包埋后切片机切片（），二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水；按照试剂盒说明书对各组结肠组织进行 染色，中性树胶封片；光镜下观结肠组织病理变化。结结肠肠黏黏液液分分泌泌观观察察 将石蜡切片放入 烘箱，随后置于二甲苯、梯度乙醇中，最后纯水漂洗。按照说明书对各组结肠组织进行 染色，中性树胶封片，显微镜下观察结肠的黏液分泌情况。法法检检测测结结肠肠肌肌层层 、蛋蛋白白表表达达的的方方法法 将冻存的结肠组织各组称取 放入 管中备用。每 裂解液中加入 混匀，取 加入各 管中，将组织剪碎后匀浆；加 裂解液，置于冰上 充分裂解；，离心，取上清液即为总蛋白。按照 蛋白定量试剂盒说明书稀释标准品，配置 工作液，各孔中加入 后 孵育；酶标仪波长为，测定吸光度并生成标准曲线，计算后得出各样本的总蛋白浓度。后依次进行电泳、转膜、封闭。洗涤后室温下加入二抗（：），摇床。用 图像分析系统对蛋白表达的灰度值进行分析，以 为内参计算蛋白的相对表达量。免免疫疫荧荧光光检检测测结结肠肠 、将石蜡切片（）置入 烘箱，随后置于二甲苯和梯度乙醇中，冲洗。玻片放入 抗原中修复 ，自然冷却后冲洗。玻片甩干后加入 过氧化氢室温孵育后 冲洗、封闭。滴加一抗随后移入 冰箱过夜；避光冲洗 ，滴加绿色荧光二抗，（）稀释，室温孵育。再次避光冲洗，滴加 染色液，室温孵育。最后 冲洗，抗荧光衰减剂封片，镜下观察。结结肠肠组组织织神神经经荧荧光光检检测测 用蛋白基因产物 来标记神经：多聚甲醛中固定的组织用 冲洗，于解剖显微镜下剥离，暴露肌间神经丛，平铺于载玻片。完全冲洗；的 溶液（，内含 ）孵育，冲洗；滴加 于 封闭；滴加一抗 （含 的 溶液稀释，比例为：），后置于 冰箱过夜；完全冲洗，滴加红色荧光二抗（避光，：稀释），室温孵育。避光完全冲洗，抗荧光淬灭剂封片，镜下观察拍片。法法检检测测检检测测结结肠肠组组织织 、表表达达 将冻存的结肠组织 完全冲洗，加入 匀浆，再加入，静置，加入 氯仿，静置 ；高速离心机 ，提取上清，记录体积。加入等体积的异丙醇静置，随后高速离心机 ，；出现透明胶状沉淀后弃去上清，加乙醇洗涤并离心，再次洗涤，室温干燥，加入 。紫外分光光度计检测 的浓度并进行逆转录，将各样本 浓度稀释为 ，取 无酶 管置于碎冰上，按逆转录试剂盒说明书配制 逆转录体系：，总 样品。反应条件：下，下，下。待产物冷却置于保存。（引物序列见表）。表 序列及引物 名称引物序列 统统计计学学处处理理 使用 软件对数据进行统计学分析，以?表示各数据。釆用单因素方差分析进行组间比较，多重时珍国医国药 年第 卷第 期 比较采用 方法。以 时差异具有统计学意义。结果 硝硝菔菔通通结结方方对对 大大鼠鼠结结肠肠组组织织病病理理学学形形态态影影响响 染色观察结肠病理形态改变情况，结果显示：空白组大鼠结肠黏膜较完整，腺体、肌层及肌间神经丛形态均正常；模型组大鼠结肠黏膜肿胀，有炎性改变，腺体排列杂乱，肌层纤维受损，神经细胞数量减少，有空泡，肌层变薄；相较于模型组，莫沙必利组炎性变化较轻；硝菔通结方组炎性浸润改善较为显著，腺体形态正常，排列整齐，肌层较模型组增厚，肌纤维坏死及神经细胞空泡减少。见图。图 各组大鼠结肠组织病理观察（染色，）硝硝菔菔通通结结方方对对 大大鼠鼠结结肠肠黏黏液液分分泌泌细细胞胞的的影影响响 染色观察结肠黏液分泌细胞情况，空白组大鼠肠道腺上皮细胞形态正常，黏膜层杯状细胞排列丰富且整齐；模型组大鼠肠道腺上皮细胞形态瘦小，黏膜层杯状细胞数量减少；莫沙必利组与模型组相比，黏膜层杯状细胞数量及黏液含量有所增加，黏膜层杯状细胞排列较为整齐；硝菔通结方组与模型组相比黏液含量增加，杯状细胞数量明显增多且排列整齐。见图。图 各组大鼠结肠 染色 硝硝菔菔通通结结方方对对大大鼠鼠结结肠肠肌肌间间神神经经丛丛形形态态的的影影响响 空白组大鼠神经纤维的分布情况呈网状，神经元数量多且神经节大；模型组大鼠的结肠肌间神经丛网状结构不完整，神经元数量减少；莫沙必利组大鼠的结肠肌间神经丛结构较模型组稍完整，但网状结构仍不完全，神经元数量较模型组增多；硝菔通结方组大鼠的结肠肌间神经丛可见较为完整的，呈网状分布的神经纤维，神经节大小及形态趋于正常，神经元数量也较丰富。见图。免免疫疫荧荧光光检检测测结结肠肠 、表表达达情情况况 与空白组相比，模型组、的表达均降低（）。与模型组比较，莫沙必利组中（）、（）、（）、（），硝菔通结方组 与 明显上升（），与 显著升高（）。见图 。图 硝菔通结方对 大鼠肌间神经丛的影响（荧光图色）图 免疫荧光检测结肠、表达与空白组比较，；与模型组比较，图 免疫荧光检测结肠、含量柱状图相较于空白组，模型组 、表达强度均降低（），与模型组相比，受体表达均升高其中 、（），（）。见图 。检检测测结结肠肠肌肌层层 、蛋蛋白白表表达达情情况况 与空白组相比，模型组、的表达水平均显著下降（）；与模型组对比，莫沙必利组及硝菔通结方组、时珍国医国药 年第 卷第 期、的表达水平均显著升高（）。见图。图 免疫荧光检测结肠 、的表达与空白组比较，；与模型组比较，图 免疫荧光检测结肠 、含量柱状图与空白组比较，；与模型组比较，（：空白组：模型组：莫沙必利组：硝菔通结方组）图 硝菔通结方对 大鼠结肠组织、蛋白表达影 检检测测结结肠肠组组织织 、表表达达 与空白组相比，模型组、的表达水平均明显下降（）；与模型组对比，莫沙必利组、的表达水平均有升高（）；硝菔通结方组、的表达水平均显著升高（）。见图。与空白组比较，；与模型组比较，图 硝菔通结方对 大鼠结肠组织、表达 讨论自主神经 肠神经系统分布在胃肠道中，素有“肠脑”之称。其含有大脑中枢神经系统与胃肠道互动的神经纤维，可通过各种神经递质如脑肠肽的释放、传递，并将中枢神经系统和胃肠道联系起来。在 患者结肠组织中发现肌间神经丛的神经元胞体及突起的数量显著减少，肌间神经丛出现退行性病变，提示 患者的 存在退行性病变，。在 中占据重要地位，其缺失或功能障碍会影响胃肠蠕动，导致胃肠运输减慢和动力的异常。在 的生长、发育及修复中起着关键作用，它能够通过 自分泌环路促进神经元的存活，减时珍国医国药 年第 卷第 期 少肠上皮细胞的凋亡，反过来 又可根据 所在位置与肠道各个细胞之间形成细胞分子桥梁达到维持肠黏膜屏障完整性的作用。与其受体结合成 复合信号通路，在 中发挥着重要作用