基于前处理方法改进的海马万应膏质量标准提升研究_胡楠.pdf

基金项目：国家药典委员会药品标准研究课题 年标准提高项目（编号：）药品检验基于前处理方法改进的海马万应膏质量标准提升研究胡楠（第一作者），曹欢，笔雪艳，（通信作者）黑龙江省中医药科学院 中药研究所（黑龙江 哈尔滨）；黑龙江省药品检验研究院（黑龙江 哈尔滨）；国家药品监督管理局 中药质量研究与评价重点实验室（黑龙江 哈尔滨）；黑龙江省中药质量研究与评价重点实验室（黑龙江 哈尔滨）摘 要 目的：优化海马万应膏的前处理过程，建立海马万应膏质量评价方法，完善海马万应膏的质量标准。方法：对海马万应膏中血竭和肉桂进行显微鉴别，采用 及 法比较直接提取和硅藻土分散法对血竭提取能力定性鉴别及方法学验证；同时进行海马万应膏质量标准研究。结果：显微鉴别可快速检视海马万应膏中血竭、肉桂相应植物组织特征；硅藻土分散法提取能力强，法斑点清晰，法分离度良好，阴性无干扰，可快速定性鉴别血竭投料情况；软化点限度合理，重量差异测定结果符合规定。结论：所优化硅藻土分散法提取率高，鉴别方法重现性好，可有效地控制海马万应膏的质量，为黑膏药质量标准提供依据和参考。关键词：海马万应膏；硅藻土分散法；质量标准中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（）：，：；，：，：；黑膏药为我国传统剂型，因其疗效确切，使用便捷，可弥补内服药药力不足、起到封闭、局部治疗的作用。但由于其剂型的特殊性，把控其工艺的同时，黑膏药质量多以经验方法判断，其药物成分、基质黏度、硬度等往往缺少具有科学性的检验，且有较多学者认为传统的黑膏药制法由于长时间高温油炸会对有效成分造成严重破坏，因此黑膏药的质量把控亟待解决。海马万应膏是由肉桂、血竭等十三味中药经过提取（煎炸）、炼油、下丹成膏、投原粉、去“火毒”、摊涂等步骤制得的传统黑膏药。具有追风，活血，止痛功效。其标准为黑龙江医药 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第三册，标准编号为，检验项目为性状、重量差异。标准中无任何专属性鉴别，不能反映其真实药材质量及生产工艺情况。本研究在首次采用硅藻土分散方法，提高药物成分的提取率，同时采用显微鉴别，薄层色谱法及液相色谱法对贵细药材血竭的真实性、有效性进行合理质控，进而对黑膏药的质控检验方法提供新思路。实验材料 仪器仪器 荧光显微镜；半自动点样仪；水浴锅；超声仪；型多功能电脑全自动软化点仪；电热恒温鼓风干燥箱；电子天平；高效液相色谱仪。试剂与药品试剂及试药均来自国药集团化学试剂有限公司。样品来自 年海马万应膏标准提高课题，血竭对照药材（中国食品药品检定研究院，批号）；血竭素高氯酸盐对照 品（中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院，批 号：）。方法与结果 性状通过对收集的样品进行性状观察，其性状均为摊于裱布上的黑膏药，表面油润细腻、光亮，乌黑无红斑。见图。图 海马万应膏样品性状图片 显微鉴别取供试品（除去裱布），剪碎（必要时可先进行冷冻），用滤纸包成圆柱形，置索氏提取器中，加三氯甲烷，加热回流提取至提取液无色，取出纸包晾干。取药渣适量，加水合氯醛透化，立即在显微镜下观察。见图。图 海马万应膏显微鉴别图片 鉴别 供试品溶液的制备直接提取法供试品溶液制备：取本品冷冻，取下膏药（除去裱背），剪成小块，取约，加甲醇，超声处理，放冷，过滤，滤渣以甲醇洗涤，合并滤液一起定容至，减压浓缩溶液至，即得 法供试品溶液。硅藻土分散法供试品溶液制备：取本品冷冻，取下膏药（除去裱背）剪成小块，取约，加三氯甲烷，超声处理 使充分溶散，溶液加硅藻土，摇匀，减压回收三氯甲烷至干（以下），药渣捣碎，加甲醇，超声处理，放冷，过滤，滤渣以甲醇洗涤，合并滤液一起定容至，减压浓缩溶液至，即得 法供试品溶液。对照药材溶液制备直接提取法对照药材溶液制备：取血竭对照药材，加甲醇，超声处理，滤过，取滤液作为对照药材溶液。硅藻土分散法对照药材溶液制备：取血竭对照药材，加三氯甲烷，超声处理 使充分溶散，溶液加硅藻土，摇匀，减压回收三氯甲烷至干（以下），药渣捣碎，加甲醇，超声处理，放冷，过滤，取滤液作为对照药材溶液。阴性供试品溶液制备 取处方中药材（除血竭外）按工艺进行黑膏药制备，即得阴性样品，取阴性样品按“供试品溶液制备方法”分别制备直接提取法及硅藻土分散法的阴性供试品溶液。对照品溶液制备取血竭素高氯酸盐对照品加甲醇制成每 含 的溶液，作为对照品溶液。测定法照薄层色谱法（中国药典 年版四部通则）试验，吸取上述供试品溶液及阴性溶液各、对照药材及对照品溶液，分别点于同一硅胶 薄层板上，以三氯甲烷甲醇（）为展开剂，展开，取出，晾干。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的橙色斑点，阴性溶液未显相同颜色橙色斑点。见图。、对照品溶液；供试品溶液直提法（）；供试品溶液硅藻土分散法（）；供试品溶液直提法（）；供试品溶液硅藻土分散法（）；供试品溶液直提法（）；供试品溶液硅藻土分散法（）；血竭对照药材直提法；血竭对照药材硅藻土分散法；阴性溶液直接提取法；阴性溶液硅藻土分散法图 海马万应膏血竭鉴别薄层色谱图（温度：，湿度：）黑龙江医药 法鉴别 供试品溶液的制备（）直接提取法供试品溶液制备：取本品冷冻，取下膏药（除去裱背），取约，剪成小块剪成小块，加甲醇，超声提取，放冷，过滤，滤渣以甲醇洗涤，连同滤液一起定容至，摇匀，用 微孔滤膜过滤，即得 法供试品溶液。（）硅藻土分散法供试品溶液制备：取本品冷冻，取下膏药（除去裱背）剪成小块，取约，加三氯甲烷，超声处理 使充分溶散，溶液加硅藻土，摇匀，减压回收三氯甲烷至干（以下），药渣捣碎，加甲醇，超声处理，超声处理，放冷，过滤，滤渣以甲醇洗涤，合并滤液一起定容至，摇匀，用 微孔滤膜过滤，即得 法供试品溶液。阴性供试品溶液制备 取处方中药材（除血竭外）按工艺进行黑膏药制备，即得阴性样品，取阴性样品按“供试品溶液制备方法”分别制备直接提取法及硅藻土分散法的阴性供试品溶液。对照品溶液制备取血竭素高氯酸盐对照品加甲醇制成每 含 的溶液，作为对照品溶液。色谱条件 参考中国药典 年版一部血竭含量测定方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈 磷酸二氢钠溶液（）为流动相；检测波长为；柱 温。理 论 板 数 按 血 竭 素 峰 计 算 应 不 低于。测定法 分别精密吸取对照品溶液，对照药材溶液，供试品溶液及阴性溶液各，注入液相色谱仪，测定，即得。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱图相应的位置上，均显现出血竭素高氯酸盐特征峰，阴性溶液色谱图中相应位置无干扰。结果见图 和见表。图 海马万应膏血竭 色谱图表 直接提取法与硅藻土分散法提取血竭素含量比较（）方法批号直接提取法硅藻土分散法 检查 软化点膏药软化点的测定，使得膏药的老嫩程度及黏度有了非常客观的评价性指标。根据 版药典四部通则 膏药软化点测定方法，对 批样品进行膏药软化点测定。结果见表。表 海马万应膏软化点测定结果（）序号厂家批号软化点 软化点 软化点平均值 企业 企业重量差异收集的 批样品均为不规则裱背材料，采用冷冻后取下样品直接测定的方法对其中 批样品进行重量差异的测定。结果见表。表 海马万应膏重量差异测定结果（）序号 企业（批号）企业（批号）企业（批号）企业（批号）标示重量 张 张 张 张限度低限量高限量平均值 讨论 成分提取的问题黑膏药由于其工艺及基质的特殊性，导致药物成分与基质难以分离，笔者通过研究，发现黑膏药基质主要为食用油黑龙江医药 科研园地福建灵芝 个主要三萜类成分的含量测定及其在溯源中的应用张基荣，张颖，蒋昆霞，陈素芳，黄黎娜，吴长辉，许文，林羽，（通信作者）福建中医药大学 药学院（福建 福州）；福建中医药大学 科技创新与转化中心（福建 福州）；福建仙芝楼科技有限公司（福建 南平）（内文见下页）和红丹，采用实验发现黑膏药剪碎后直接提取，药物成分会由于提取溶剂对基质溶解能力较弱的弊端，导致无法将药物分散使成分充分地从基质中单独提取出来，因此采用一种新方法，既能将基质分散开，又能使试剂进行有效提取。实验发现采用松散粉末状硅藻土这种材料加到被三氯甲烷溶散的膏体混悬液中，充分混匀，再减压回收三氯甲烷至干，这时无论是药物成分还是基质都均匀分布于硅藻土中，再用极性较大且油性基质不易溶入的甲醇溶液进行提取，仅仅提取出易溶于甲醇的药物成分。这样就避免了基质的干扰，使得检验结果能够更加具有科学性，笔者在实验中发现硅藻土的加入并未对海马万应膏中的血竭相应成分具有较强的吸附作用，并且分散后血竭素成分提取浓度提高 倍，且斑点清晰度更加显著。因此可以进行硅藻土分散黑膏药方法的开发及应用。制备工艺问题海马万应膏中处方共 味，其中除肉桂和血竭外均为药材经油炸枯后收膏入药，此次标准研究针对处方中毒麻类药材（附子、麻黄）、贵细药（海马及其他当归、白芷等）均进行针对性研究，并且比较了药材油炸前后的成分变化。结果发现，未经油炸的药材均能检出药物成分，而按膏药工艺制备的药材由于经过高温油炸后，均未检出相应药物成分。考虑到黑膏药的工艺，可能药物的成分被高温破坏，有治疗作用的药物成分是否是高温加热后产生的新物质，黑膏药的质量因未能得到较合理的标准控制，相对而言是存在一定的风险问题，也有人建议将黑膏药中有效成分采用现代提取技术，制备成巴布剂或贴膏剂代替黑膏药剂型，不仅可以避免黑膏药长期使用重金属铅蓄积中毒的风险还能有效控制药品质量。裱背材料的问题根据与企业沟通，近年考虑患者使用的便捷性及卫生情况，黑膏药摊涂裱背均采用一种形状不规则的材料，称为医用透气胶带。这种裱背材料的好处在于患者使用黑膏药时不会因为膏体受热后流动溢出或渗透裱背污染衣物，此裱背原材料使用前均参考器械标准进行检验。由于这种裱背形状不规则，分布不均匀的特点，在重量差异法检验中不能采用药典标准通过单位面积换算来测定重量，而是进行采用先冷冻，再将膏体剥离裱背，直接称量膏体重量的方法测定黑膏药重量，裱背上残留的膏体较小或几乎无残留，对限度及结果几乎无影响，忽略不计。这也提示检验标准需要与时俱进，更新换代。质量标准问题本次研究针对原粉投料的血竭及肉桂新增显微鉴别、对贵细药血竭采用硅藻土分散法提升血竭素高氯酸盐提取率，并新增其 鉴别、鉴别方法，同时制定合理的软化点限度。增加质控项目，在一定程度上规范企业生产控制。参考文献 周楠，曹欢，笔雪艳，等中药传统剂型黑膏药的研究进展中国药品标准，（）：吴师机理淪骈文北京：中国中医药出版社，：郭新苗中药黑膏药制剂生产中的质量风险管理中国药物警戒，（）：王丹丹，张虹黑膏药的质量控制研究探讨中国卫生产业，：张清，余新启黑膏药疮疡膏工艺及质量标准研究时珍国医国药，（）：毛兆雄浅论中药黑膏药工艺的现代研究中医药学报，：张博华，张义生，李杰，等小儿咳喘贴黑膏药的制备工艺研究中国药师，（）：李力，王薇，杨柳，等黑膏药鼻炎贴不同摊涂工艺的皮肤安全性比较研究中国药师，（）：陈爱华，王森，刘红宁，等传统黑膏药发展近况探讨中成药，（）：中华人民共和国卫生部药典委员会中华人民共和国卫生部标准（中药成方制剂第三册），：国家药典委员会中华人民共和国药典，一部，：付敏，张莉，韩建伟狗皮膏三种剂型中四种药材的薄层鉴别比较湖北中医杂志，（）：李帆帆，孟宪丽，赵贵琴，等狗皮膏大鼠长期毒性试验的体内血液铅变化研究 中国中药杂志，（）：乔婷婷，刘圣金，林瑞超，等含矿物类中药外用制剂的药理毒理作用研究进展 中国现代中药，（）：收稿日期：黑龙江医药