基于色差原理及指纹图谱对淡竹叶药材质量评价研究_张衍旭.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：吉林省科技发展计划项目（）作者简介：张衍旭（），男（汉族），吉林敦化人，长春中医药大学在读硕士研究生，主要从事中药学研究工作通讯作者简介：董雪莲（），女（汉族），吉林长春人，长春中医药大学讲师，在读博士研究生，硕士学位，主要从事中药新药开发及中药保健食品研发工作基于色差原理及指纹图谱对淡竹叶药材质量评价研究张衍旭，邱智东，高英鑫，王野谌，董雪莲（长春中医药大学药学院，吉林 长春）摘要：目的 建立淡竹叶中荭草苷、异荭草苷含量测定方法，研究含量与药材颜色相关性。通过指纹图谱结合化学模式识别分析不同产地淡竹叶质量，为其质量控制提供依据。方法 收集 个产区共 批淡竹叶，采用 测定荭草苷、异荭草苷含量，色差仪测定其色度值（、），利用 软件分析颜色与含量相关性；采用 建立指纹图谱，通过聚类分析（）、主成分分析（）、正交偏最小二乘法判别分析（）评价淡竹叶药材质量。结果 批淡竹叶中荭草苷、异荭草苷平均含量分别为 ，含量与颜色有显著相关性（），荭草苷、异荭草苷含量与 呈显著负相关，与、呈显著正相关。淡竹叶指纹图谱确定 个共有峰，指认其中 个成分。、结果基本一致，将 批淡竹叶分为 类，筛选得到 个质量差异标志性成分。结论 淡竹叶颜色与荭草苷、异荭草苷含量有密切相关性，颜色越亮且偏向黄绿色，说明淡竹叶中荭草苷、异荭草苷含量越高。建立淡竹叶指纹图谱并结合化学模式识别研究，可为后续淡竹叶的质量控制和资源开发提供参考。关键词：淡竹叶；颜色；荭草苷；异荭草苷；指纹图谱；色差原理；化学模式识别 标识：中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）淡竹叶为禾本科植物淡竹叶 的干燥茎叶，具有凉心缓脾，清痰止渴的功效。现代研究表明淡竹叶中荭草苷、异荭草苷具有抗菌、抗病毒、抗过敏等作用，荭草苷可降低血清肌酸磷酸酶（）、乳酸脱氢酶（）活性，并能提高超氧化物歧化酶（）活性。异荭草苷能抑制内毒素血症小鼠外周及脑内炎症，抑制小胶质细胞活化，尤其能抑制 型活化，并升高脑内 水平，发挥神经保护作用。淡竹叶因具有广泛药理作用，在现代中药制剂生产中有广泛应用，含有淡竹叶的相关中成药制剂有银翘解毒合剂、银翘散、小儿清热化痰栓、五粒回春丹、羚羊感冒颗粒等。因此，建立淡竹叶药含量测定方法，可为相关制剂质量标准建立提供依据。颜色作为药材性状鉴别的重要指标，可直接影响药材质量，其根源可能是由于有效成分发生改变。传统药材优劣鉴别多以主观评价为主，但对于大生产化可行性低，本研究基于色差原理，使用色差仪对药材粉末进行量化分析（代表亮度，与 分为黑色和白色，值正负代表红色和绿色，值正负代表黄色和蓝色，、绝对值越大颜色越深）。客观评价药材色泽，讨论药材外观颜色与有效成分（荭草苷、异荭草苷）含量的相关性并建立指纹图谱，通过指纹图谱与、和 等化学模式识别技术相结合，为评价不同产地药材质量提供有效的参考，为淡竹叶质量控制及评价提供依据。仪器与材料 仪仪器器 型高效液相色谱（）仪、型电脑色差仪（深圳三恩驰科技有限公司）、型电子天平、型十万分之一电子天平梅特勒 托利多仪器（上海）有限公司、型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）等。药药品品与与试试剂剂 荭草苷对照品（批号：）、牡荆素对 照 品（批 号：）、异 牡 荆 素 对 照 品（批 号：）以上对照品均购自上海源叶生物技术有限公司，质量分数；绿原酸对照品（批号：）、异荭草苷对照品（批号：）以上对照品均购自中国食品药品检定研究院，质量分数；磷酸、甲醇、乙腈均为色谱纯；乙醇为分析纯；水为娃哈哈纯净水。批淡竹叶收集自四川、云南、湖南、广东、安徽 个产区，经长春中医药大学药学院中药鉴定学翁丽丽教授鉴定为禾本科植物淡竹叶 的干燥茎叶。具体信息见表。表 淡竹叶样品来源信息批号编号采样产地批号收集日期四川达州市 四川达州市 四川达州市 云南曲靖市 云南曲靖市 云南曲靖市 湖南常德市 湖南常德市 湖南常德市 广东广宁市 广东广宁市 广东广宁市 安徽六安市 安徽六安市 安徽六安市 方法与结果 荭荭草草苷苷、异异荭荭草草苷苷含含量量测测定定 供供试试品品溶溶液液的的制制备备 取淡竹叶样品 粉末（过四号筛），加 乙醇，称重，超声（，），放冷，称重，加 乙醇补重，摇匀，滤过，滤液经 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。对对照照品品溶溶液液的的配配制制 分别取荭草苷、异荭草苷对照品适量，精密称定，加 乙醇定容至，得到浓度分别为 、的混合对照品溶液。色色谱谱条条件件和和系系统统适适用用性性考考察察 色谱柱为 色 谱 柱（，）；流 动 相 为 乙 腈（）磷酸溶液（），梯度洗脱（，；，时珍国医国药 年第 卷第 期；，；，；，；，）；流速为 ；检测波长为 ；柱温为；进样量为。取“”“”项下淡竹叶供试品和对照品溶液进样测定，结果见图 。图 淡竹叶供试品 图图 荭草苷、异荭草苷对照品溶液 图 线线性性关关系系考考察察 精密吸取浓度分别为 、的荭草苷、异荭草苷混合对照品溶液适量，稀释成一系列不同质量浓度的对照品溶液（），按照“”项下色谱条件进行测定，以对照品质量浓度为横坐标（），以峰面积为纵坐标（）绘制标准曲线，进行线性回归，结果见表。表 淡竹叶中荭草苷、异荭草苷线性关系考察成分回归方程线性范围 荭草苷 异荭草苷 精精密密度度试试验验 取“”项下混合对照品溶液，按照“”项下色谱条件进行测定 次，记录峰面积，计算得荭草苷、异荭草苷峰面积 分别为，（），表明仪器精密度良好。重重复复性性试试验验 取淡竹叶粉末（），按照“”项下方法制备供试品溶液 份，再按“”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算得荭草苷、异荭草苷含量分别为 ，。分别为、（），表明方法重复性良好。稳稳定定性性试试验验 取淡竹叶粉末（），按照“”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置、按“”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。荭草苷、异荭草苷峰面积的 为、（），表明供试品溶液在室温下放置 内稳定。加加样样回回收收率率试试验验 取已知成分含量的淡竹叶粉末（），共 份，按：质量比精密加入对照品，按照“”项下方法制备供试品溶液，再按“”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算加样回收率及，结果见表。表 荭草苷、异荭草苷加样回收率试验结果成分取样量 已知含量 加入量 测得量 加样回收率 平均加样回收率 荭草苷 异荭草苷 淡淡竹竹叶叶中中荭荭草草苷苷、异异荭荭草草苷苷的的含含量量测测定定 取 批淡竹叶药材粉末，按照“”项下方法制备供试品溶液，再按“”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并按外标法计算含量。每批样品平行测定 次，取平均值，见表。表 批淡竹叶药材样品中荭草苷、异荭草苷含量的测定结果编号荭草苷 异荭草苷 淡淡竹竹叶叶药药材材的的颜颜色色测测定定 使用 型电脑色差仪测定淡竹叶药材的颜色。色色差差仪仪测测定定条条件件 光源选择：；视场选择：度视角；测定孔径：；光源：蓝光激发；仪器误差：。对仪器进行黑白板校正以后，取样品粉末（过四号筛）适量，均匀平铺于测试盒内，进行测定，记录色度值（、）。精精密密度度考考察察 取淡竹叶粉末（）适量，按“”项下测定条件，连续测定 次，记录、值。结果 （），表明仪器精密度良好。重重复复性性考考察察 取淡竹叶粉末（）份，按“”项下测定条件测定，记录、值。结果 （），表明方法重复性良好。稳稳定定性性试试验验 取淡竹叶粉末（）适量，分别在室温下放置、后，按“”项下测定条件测定，记录、值。结果上述色度值 （），表明样品在 内稳定性良好。淡淡竹竹叶叶样样品品颜颜色色测测定定 取 批淡竹叶药材，按“”项下测定条件测定，记录、值。每批样品平行测定 次，取平均值，结果见表。表 批淡竹叶药材色度值测定结果编号颜色浅绿色 浅绿色 浅绿色 深黄绿色 深黄绿色 深黄绿色 浅绿色 浅绿色 浅绿色 浅黄绿色 浅黄绿色 浅黄绿色 黄绿色 黄绿色 黄绿色 淡淡竹竹叶叶药药材材有有效效成成分分含含量量与与颜颜色色相相关关性性相相关关性性分分析析 利用 软件，对 批淡竹叶药材颜色测定结果与含量测定结果进行分析，进行 相关性分析，结果见表。根据 颜色空间，代表亮度，与 分为黑色和白色，代表红 绿色轴，负值与正值分别代表绿色与红色，时珍国医国药 年第 卷第 期 代表黄 蓝色轴，负值与正值分别代表蓝色与黄色。根据上述结果分析，淡竹叶中荭草苷、异荭草苷含量与 呈显著负相关，与、呈显著正相关。淡竹叶、值越大，荭草苷、异荭草苷含量越高。值越小，则其含量越高。淡竹叶颜色越偏黄绿色且越明亮，荭草苷、异荭草苷含量越高。表 淡竹叶药材颜色测定结果与有效成分含量的相关性分析（）荭草苷 异荭草苷 ：在 水平（双侧）上显著相关；淡淡竹竹叶叶药药材材的的指指纹纹图图谱谱建建立立 对对照照品品溶溶液液的的制制备备 分别精密称取绿原酸、荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素、木犀草苷对照品适量，加 乙醇制成浓度分别为 、的混合对照品溶液。供供试试品品溶溶液液的的制制备备 取淡竹叶样品粉末（过四号筛），加 乙醇，称重，超声（，），滤过，用乙醇 分 次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加 乙醇溶解，转移至 量瓶中，加 乙醇至刻度，摇匀，经 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。色色谱谱条条件件 色谱柱为 色谱柱（，）；流动相为乙腈（）磷酸溶液（），梯度洗脱（，；，；，；，；，；，）；流速为 ；检测波长为；柱温为；进样量为。精精密密度度试试验验 取淡竹叶供试品溶液（），按“”项下色谱条件连续进样 次，以 号异荭草苷色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间 ，相对峰面积 ，表明仪器精密度良好。重重复复性性试试验验 取淡竹叶药材粉末（）份，按“”项下方法平行制备供试品溶液，再按“”项下色谱条件测定，以 号峰（异荭草苷）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间 ，相对峰面积 ，表明方法重现性良好。稳稳定定性性试试验验 取淡竹叶药材粉末（），按“”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置、后按“”项下色谱条件测定，以 号峰（异荭草苷）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间 ，相对峰面积 ，表明供试品溶液在室温下 内稳定性良好。相相似似度度评评价价及及共共有有峰峰指指认认 取 批淡竹叶样品粉末，按“”项下方法制备供试品溶液，再按“”项下色谱条件测定，记录色谱图。将 批样品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（版）进行分析，以 为参照图谱，采用中位数法，经多点校正后匹配生成淡竹叶指纹图谱，见图。样品 与对照图谱（）相似度分别为 、。确定共有峰 个，通过与混合对照品溶液的色谱图（图）对比，指认出 个成分，分别为绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆素、异牡荆素。不不同同产产地地淡淡竹竹叶叶药药材材的的聚聚类类分分析析（）将 批淡竹叶的共有峰峰面积导入到 统计软件，以组间联接法及皮尔逊相关性作为分类依据进行聚类分析。当欧氏距离小于 时，批淡竹叶可分为两类，第一类为 、，以四川、湖南产淡竹叶为主；第二类 、，以云南、广东、安徽为主。当欧氏距离小于 时，批淡竹叶可分为三类，第一类为 、，以四川、湖南产淡竹叶为主；第二类为 ，以云南产淡竹叶为主；第三类为 ，以广东、安徽产淡竹叶为主。图 可以得出不同省份间淡竹叶存在差异，以四川、湖南，广东、安徽与云南产地淡竹叶差异明显。图 批淡竹叶样品 叠加图谱（）图 混合对照品溶液的 图图 批淡竹叶样品聚类分析图 不不同同产产地地淡淡竹竹叶叶药药材材的的主主成成分分分分析析（）将 批淡竹叶共有峰的峰面积导入 软件，结果得出主成分特征值及方差贡献率，见表。以特征值 得到 个主成分，累积方差贡献率为 。表明 个主成分对于淡竹叶药材可以进行较为全面的解释。分析得到淡竹叶样品初始因子载荷矩阵，见表。表 淡竹叶样品主成分特征值及方差贡献率成分特征值方差贡献率 累积方差贡献率 再将 批淡竹叶共有峰峰面积导入 软件建立 模型，与 分析聚类结果基本一致，见图，批淡竹叶分为三类，第一类为 ，第二类为 ，第三类为 。从相关因素载荷图（见图），得到三个主成分，方差贡献率分别为 、，与 分析所得方差贡献率基本一致，说明本模型的预测