基于抗真菌药物研发的理论及实践教学探索_于桂洪.pdf

2023年第22卷 第1期产业与科技论坛2023（22）1Industrial&Science Tribune基于抗真菌药物研发的理论及实践教学探索于桂洪【内容摘要】近年来，随着器官移植、外科介入等手术的增多以及艾滋病、呼吸道冠状病毒感染等疾病的蔓延，侵袭性真菌引起的深度感染日益增多。此外，目前使用的抗真菌药物常存在毒副作用且多已出现耐药现象，导致每年因侵袭型真菌感染而死亡的人数达 万以上。因此，寻找新型抗人类致病真菌的药物迫在眉睫。青岛农业大学生命科学学院开设了活性物质分离与生物合成研究生课程，以筛选抗侵袭性致病真菌活性物质为导向，教授微生物代谢产物挖掘技术、活性评价技术和生物合成研究技术等内容，探究在实践与理论并重的教学模式下培养学生。本研究能为生物与医药相关方向人才的培养提供重要参考。【关键词】生物与医药；微生物；活性次级代谢产物；实践教学【基金项目】本文为国家自然科学青年基金项目（编号：）、青岛农业大学高层次人才基金项目（编号：）、山东省重点研发项目计划课题（编号：）研究成果。【作者简介】于桂洪（），女，山东泰安人，青岛农业大学生命科学学院、山东省应用真菌重点实验室，副教授，硕士生导师，博士；研究方向：微生物活性次级代谢产物 侵袭性真菌感染（）是一种机会性感染，感染人体的血液和深层器官，主要发病于免疫功能低下的人群，如免疫缺陷病患者、癌症、器官移植者和糖尿病患者等。其中，侵袭性念珠菌，主要为白色念珠菌（），是最常见的致病真菌之一，占侵袭性感染的 ，并导致了免疫功能低下患者的高死亡率（）；而另一类致病真菌 隐球菌，主要指新隐球菌（）和格特隐球菌（），每年感染超过 万人，死亡率为 。目前，临床上用于治疗侵袭型真菌感染的药物主要包括唑类（如氟康唑、伏立康唑等）、多烯类（如两性霉素）、棘白菌素类（如卡泊芬净）和 氟胞嘧啶等，但以上药物常存在毒副作用，如两性霉素 具有较大的肾毒性、肝毒性，使用严重受限。此外，由于抗生素的滥用和使用不规范，“耳念珠菌”等耐药性超级真菌层出不穷，使得真菌感染的治疗难度更大，形势更加严峻，棘白菌素、唑类和 氟胞嘧啶等药物均已出现不同程度耐药现象，。因此，亟需寻找新型抗人类致病真菌的药物。研究表明，食药用真菌能够产生多种多样的活性天然物质，是药物先导化合物的重要来源，例如来源于药用真菌灵芝（）的灵芝酸具有保肝护肝、抗肿瘤、抗 病毒等活性，来源于食用菌 （分离时原名为侧耳属的 ）的截短侧耳素对革兰阳性菌具有显著抑制活性。来源于食用菌杏鲍菇（）的 对人肝癌细胞 和人宫颈癌细胞 具有强细胞毒性。目前食药用真菌的活性物质研究主要集中于子实体的研究，需要采集或购买大量的子实体，难以实现活性物质的工业化生产。虽然通过菌丝发酵可以缓解该问题，但是常规的菌丝单培养发酵常常导致基因簇的沉默，使得代谢产物的重复分离现象严重，已成为开发利用该药用资源的瓶颈问题。目前用于激活真菌沉默基因簇的策略主要有（）、基因工程、共培养等。策略通过改变培养条件和培养基成分等方法获得结构的多样性，是微生物代谢潜力挖掘的重要手段，简单有效，但难以定向激活某一类物质。近年来，随着分子生物学技术快速发展，通过基因层面的直接操控（高表达转录因子、组蛋白去乙酰化酶基因敲除、异源表达等策略）来激活微生物沉默基因簇更容易实现。然而，食药用真菌的遗传操作体系较为复杂，虽然在少数食药用真菌如 四、结语综上所述，教育理念以学生为中心，以成果为导向开展教学活动，强调学生实践能力和思维能力的培养。本文对 模式下土木工程专业设计类课程改革进行了探究，从教学目标、教学内容、教学方法以及教学评价等方面进行分析，并以学生为中心，以学生的学习成效为出发点展开教学，对教学质量进行了改进，有助于土木工程专业学生综合素质、创新能力、实践能力的全面提升。【参考文献】张彩利，宋倜，孙吉书，马士宾 新工科背景下道路桥梁与渡河工程专业经管类课程 教育模式设计 高教学刊，：孔翠薇，郝维仁 基于 模式的学前教育专业“幼儿园教育活动设计”类课程的教学实践 山西青年，：刘旭堂，黄梦婕，王伟 模式下工业设计专业设计类课程多元化教学模式改革 西部素质教育，（）：李宗民，蔡小霞 大类培养模式下工业设计专业软件类课程的教学方法探讨 工业设计，：产业与科技论坛2023年第22卷 第1期Industrial&Science Tribune2023（22）1，中已实现过表达和基因编辑，但基因转移和同源重组效率较低，且缺乏有效的基因编辑元件，因此尚难以通过基因层面的直接操控来激活食药用真菌的沉默基因簇。相比而言，共培养策略通过菌株间相互作用激活沉默基因簇，可以快速获得结构新颖的活性次级代谢产物，尤其是抗菌活性物质，是深入研究食药用菌资源的重要手段。青岛农业大学生命科学学院山东省应用真菌重点实验室长期致力于食药用真菌功能活性成分的挖掘与产业化，在此基础上，我们已经成功获得了多种抗人类致病真菌及抗肿瘤活性的物质。其中，食药用真菌灰树花发酵液多糖提取及药理作用研究获山东省科技进步奖一等奖，药用真菌树舌灵芝生物学特性及其活性成分的研究获山东省技术发明奖二等奖，药用真菌灰树花胞外多糖发酵生产技术实现 万元科研成果转让并成功转化。学校为培养创新型人才，在普通微生物学及微生物学（双语）理论课程的基础上，理论结合实践，进一步开设了活性物质分离与生物合成这门理论与实验并重的课程。本课程旨在以抗侵袭型真菌活性物质的分离为切入点，围绕食药用真菌特色种质资源，基于共培养策略和活性导向策略设计教学过程，对学生的科研生涯进行启蒙，使学生在理论学习的基础上参与科学研究，为后期学术研究的开展打下坚实的基础。一、教学设计本课程共 个学时，其中理论课程和实践课程的学时各为 学时。理论课程教授内容包括活性物质分离、结构鉴定、活性评价、生物合成和文献检索手段等课程内容，旨在教授微生物活性天然产物分离与生物合成相关知识，为实验课的开展提供理论基础。实践课程主要进行微生物的培养、代谢产物的提取分离、化合物结构鉴定、高效液相分析、抗人类致病菌活性评价。该课程以往并没有侧重抗人类致病菌活性评价，但由于该类药物研发的迫切性，我们在实验课的开设过程中，逐渐倾向于以抑菌活性物质筛选为切入点，并引入共培养策略，提高抑菌活性物质的合成效率。以上改进，也为该专业人才后期从事高抑菌活性物质研究、创新药物研发等方向的工作提供了研究基础。二、具体教学方案（一）理论课程设计方案。理论课程包括活性物质分离和鉴定技术 学时、活性评价方法 学时、生物合成途径 学时和文献检索手段 学时，共计 学时。该课程设置能够将基础知识简明扼要地教授给学生，在此基础上学生可借助学习到的文献检索手段进一步深入学习，完善知识体系，且课后设有教师答疑环节，学生可在教师的帮助下消化理解以上理论知识。活性物质分离鉴定技术（学时）。活性物质的分离和结构鉴定是天然药物研发的基础。本课程在活性物质分离方面主要介绍正相硅胶柱、反相硅胶柱、凝胶柱等柱层析方法、液相 质谱（）联用等目标化合物追踪技术、高效液相色谱等分离手段；在结构鉴定方面主要介绍核磁共振（）、质谱（）、紫外（）、旋光（）、红外（）、单晶衍射、化学衍生（如 反应）、圆二色谱（）、计算量子化学等技术。活性评价方法（学时）。掌握化合物的活性评价方法是筛选活性物质的前提。本课程主要介绍肉汤微量稀释法和纸片扩散法，其中，肉汤微量稀释法适合单细胞致病菌的抑制活性评价，如细菌、酵母菌等，本课程采用的白色念珠菌和新隐球菌均属于酵母菌，因此，采用肉汤微量稀释法在 孔板中进行评价，该方法检测速度快，通量高，是目前最常用的抗菌活性检测方法之一。纸片扩散法适用范围比较广泛，细菌和真菌的抑制活性评价均可使用。侵袭性真菌除白色念珠菌和新隐球菌外，还有曲霉属等丝状真菌，该类真菌一般通过菌丝的延长进行生长，多采用纸片扩散法进行抑制活性的评价。生物合成途径（学时）。合成生物学是生物科学中的重要分支，天然活性物质的生物合成研究是目前的热点方向。研究表明，不同类型的化合物具有不同的生物合成途径，如萜类化合物通过异戊二烯途径生成、生物碱类化合物通过氨基酸途径生成，酚类化合物则通过莽草酸途经和乙酸途径生成。掌握和探索活性物质的生物合成途径不仅有利于化合物结构的解析和生物功能的确定，还可以指导化合物的仿生合成、异源表达和发酵生产，在科学研究和工业生产中均具有重要意义。因此，本课程将教授典型活性天然产物在生物体内的合成过程，使天然物质的发现与生物合成研究相关联，有助于学生触类旁通、开阔视野并进一步拓展研究思路。文献检索手段（学时）。在科学研究中，文献检索是一项必备能力，例如我们需要通过查阅文献了解相关领域的研究现状，避免重复选题，此外，在研究过程中往往需要借鉴前人的技术手段进行更深入的探索。因此，本课程将教授学生文献检索的手段，包括中国知网、万方、维普等中文数据库和 、和 等外文数据库的使用方法和检索技巧。（二）实践课程设计方案。实践课程包括微生物选择、共培养 课时、次级代谢产物的提取 课时、活性评价 课时和高效液相分析 课时，共计 学时。在此基础上，安排研究生对课程中发现的活性显著提高且差异峰明显的共培养组合进行下一步研究，分离鉴定活性物质，从而衔接到课后的科研工作，使研究生可以快速进入到学术研究工作中去。微生物选择、共培养（课时）。本课程依托的山东省应用真菌重点实验室具有丰富的食药用真菌资源，首先从中选择适量菌株进行共培养筛选。利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（）制作的平板进行培养（，天），选取有较强对峙线的菌株进行代谢产物的提取。如图 为药用真菌槐耳 和云芝 共培养，其对峙线较为明显，该现象暗示会产生新颖抑菌活性物质。次级代谢产物的提取（课时）。培养结束后，对培养基上的菌丝进行萃取。由于培养基中含有一定水分，因此可以先利用甲醇萃取，获得的甲醇溶液用旋转蒸发仪浓缩，再用乙酸乙酯萃取，最后将乙酸乙酯相用旋转蒸发仪浓缩获得粗提物。粗提物的活性评价（课时）。以侵袭性人类致病真菌 新隐球菌和白色念珠菌为活性评价模型，利用 孔板进行活性筛选，粗提物初始浓度为 。以制霉菌素和氟康唑为阳性药，初始浓度为 。通过与阳性药对比，确定粗提物的活性水平。2023年第22卷 第1期产业与科技论坛2023（22）1Industrial&Science Tribune图 槐耳 和云芝 的对峙现象 高效液相分析（课时）。将活性比单培养高的共培养组合进行高效液相分析。粗提物配置浓度为 ，进样体积为 。以甲醇和水为流动相，分析方法为 甲醇 水 ；.由甲醇 水 梯度变化为 甲醇；甲醇。分析完毕后，对单培养和共培养的谱图进行对比，确定差异峰或者产量提高的色谱峰。化合物的分离和鉴定（衔接课后科研工作）。安排研究生对活性提高显著且差异峰明显的共培养组合进行下一步研究，确定目标峰的化学结构并评价活性，从而衔接到课后的科研工作，有该方向研究兴趣的研究生可以快速进入科研状态。深入研究过程中，首先要进行共培养的放大发酵。发酵完成后进行粗提物的提取，进而利用柱层析和高效液相色谱等技术在活性指导下进行差异峰的分离。最后，通过核磁共振谱图测试、理化常数分析、单晶衍射、计算量子化学等技术确定目标化合物的化学结构，并进行抗侵袭性真菌活性评价，从而获得高活性抑菌物质，为新型抗真菌药物的发现提供研究基础。课程评测方式。经过本课程学习后，学生需提交课程论文，展示检索的最新代谢产物挖掘策略，并通过学术汇报等形式介绍本课程中的研究进展和收获。三、教学特色目前，侵袭性致病真菌严重危害着人类的生命和生活质量，随着低免疫力人群的增多和致病菌耐药性的增强，迫切需要寻找新型抗人类致病真菌药物。本课程旨在培养学生发现新型抗真菌药物的科研能力，使学生有机会参与到创新药物的发现和评价中，对于其研发兴趣和能力的培养具有重要意义，同时也为新药的创制提供了重要的研究基础。本课程的设计实现了从理论到科研创新的过渡，帮助学生更好地开展科学研究，具有一定的创新性和前沿性。此外，本课程还教授学生相关领域基础知识和文献查阅手段，促进学科交叉，使学生能够自主学习最新的文献，即使进入新的研