基于均匀设计法的粗品糖肽的提取工艺研究_唐碧蓉.pdf

2022 年12 月Dec.2022第 46 卷 第 6 期Vol.46,No.6热 带 农 业 工热 带 农 业 工 程程TROPICAL AGRICULTURAL ENCINEERING基于均匀设计法的粗品糖肽的提取工艺研究唐碧蓉1,2)黄敬春1,2)石星亨1,2)唐赵强1,2)曾艳红1,2)陈丽欣3)卓林娟1,2)符文耀1,2)王会娟1,2)蒋淑荣1,2)（1 广东蔚徕实验室科技发展有限公司 广东湛江 524000；2 广东科诚实验室装备有限公司 广东湛江 524000；3 农本科技（湛江）有限公司 广东湛江 524000）摘要 针对国内糖肽制品原料多来源于灵芝、云芝、纳豆菌、人参等，导致产品成本较高，本研究以成本相对低廉的猪十二指肠为原料，采用均匀设计法对糖肽提取温度、时间和pH值3因素进行优化，得到最佳条件为取温度为100，提取时间为10 min，pH值为10.46，糖肽提取率达1.49%，该提取方法工艺稳定，提取率高。关键词 糖肽；猪十二指肠；提取纯化；均匀设计中图分类号 TS201.2 Extraction Process of Crude Glycopeptide Based on Uniform DesignTANG Birong1,2)HUANG Jingchun1,2)SHI Xingheng1,2)TANG Zhaoqiang1,2)ZENG Yanhong1,2)CHEN Lixin3)ZHUO Linjuan1,2)FU Wenyao1,2)WANG Huijuan1,2)JIANG Shurong1,2)(1 Zhanjiang Kecheng Trading Co.,Ltd.,Zhanjiang,Guangdong 524000;2 Guangdong Kecheng laboratory equipment Co.,Ltd.,Zhanjiang,Guangdong 524000;3 Agricultural Technology(Zhanjiang)Co.,Ltd.,Zhanjiang,Guangdong 524000)Abstract View of the high cost of domestic glycopeptide products extracted from Ganoderma lucidum,Coriolus versicolor,natto bacteria,ginseng and other raw materials,this study took the relatively low-cost pig duodenum as the raw material,and optimized the extraction temperature,time and pH value by using the uniform design method.The optimum extraction conditions were as follows:temperature 100 ,time 10min,pH value 10.46,the extraction rate of glycopeptide was 1.49%,and the extraction process was stable,The extraction rate is more than twice that of foreign related technologies.Keywords glycopeptide;pig duodenum;extraction and purification;uniform setting糖肽是一类寡糖与多肽相结合的大分子化合物，糖肽在如糖肽类抗生素和抗肿瘤疫苗的糖类药物研发中有着十分重要的应用。糖肽合成难度较大1-2，国内多以灵芝、云芝、纳豆菌、人参等原料进行提取，成本较高3-7；国外多以猪胃黏膜或猪十二指肠为原料进行提取，成本相对低廉。广东省年出栏生猪 3 300万头、年消费生猪 5 000万头，是生猪生产和消费的大省，具备制造糖肽的物质基础。目前，国内因糖肽提取效率不高，多为进口，因此，有必要对硫酸糖肽生产工艺进行优化。本研究以猪十二指肠为原料，采用均匀设计法对提取温度、时间、pH值进行优化，以期改进国内糖肽提取工艺。1 材料与方法 1.1材料猪十二指肠；丙酮（莱阳经济技术开发区精细化工厂）；氢氧化钠溶液；醋酸溶液；氯化钠；胰蛋白酶。收稿日期：2022-04-28；编辑部E-mail：；责任编辑：汪全伟。唐碧蓉（1977），女，本科，主要从事农产品质量检测检验研究。通讯作者：黄敬春（1977），男，本科，主要从事农产品质量检测检验研究。-118唐碧蓉 等 基于均匀设计法的粗品糖肽的提取工艺研究1.2方法1.2.1均匀实验设计根据预试验，选定提取温度（X1）70100、时间（X2）1040 min、pH值（X3）为810，以粗品产量为指标，运用王玉方“均匀设计3.00软件”，采用用U6*（64）均匀设计表设计实验。1.2.糖肽提取选取冰冻的猪十二指肠500 g绞碎成糜状，置于烧杯中，加入500 mL水，按表1方案进行碱解，然后用80%醋酸调节pH值至4.7左右，冷却。纱布过滤，向滤液加入 0.5 倍体积的丙酮，离心（3 000 r/min、15 min）；上清液中加入药液体积4倍量的丙酮，分级沉淀，沉淀物用丙酮脱水2次。50 真空干燥，得到碱解后糖肽。将碱解后粗品溶于500 mL纯化水，加入15 g分析纯氯化钠，加入酶解后粗品质量1%的胰蛋白酶，45、pH值8.5条件下酶解5 h，过滤，滤液分级、脱水、干燥，得到粗品糖肽。2 结果与分析 均 匀 设 计 试 验 结 果 如 表 1 所 示，应 用“DPS9.50标准版”软件对试验结果进行二次多项式逐步回归分析。2.1单因素影响分析选用模型最大值为寻优类别，研究模型诊断（单因素影响）温度、提取时间、pH值对提取率的影响。由图13可以看出，随着提取温度的增加，提取率增加；随pH值的增大，糖肽提取率增加；随着提取时间的延长，提取率降低。当提取时间为34 min时，提取率最低，可能原因是随着提取时间的延长，糖肽降解为小分子物质。无法被非水溶剂沉淀；2.2三因素综合影响分析采用“DPS9.50标准版”软件进行线性回归，得到线性回归方程为Y=-3.411 7+0.017 3X1-0.008 0X2+0.316 1X3，其中相关系数R=0.929，F值=4.219 1，表1均匀设计试验结果序号123456温度/7076828894100时间/min162840102234pH值8.810.08.49.68.09.2粗品糖肽提取率/%0.316 00.617 40.395 21.078 00.483 20.859 4图1不同温度的提取率图2不同时间的提取率图3不同pH值的提取率-1192022 年 12 月第 46 卷第 6 期热带农业工程回归方程不显著。各因素影响强弱顺序为pH（X3）提取温度（X1）提取时间（X2），pH值为糖肽提取率的主要因素，提取时间和温度为次要因素。以粗品糖肽提取率为因变量，各因素为自变量，采用DPS软件对试验结果进行二次多项式逐步回归分析，回归方程为 Y=-1.299-0.005 08X2+0.000 827X2X2-0.000 520X1X2+0.003 320X1X3。对方程进行显著性检验，复相关系数R=0.998，决定系数R2=0.997，F值=81.07，p=0.083 1，说明回归方程有显著意义。综合提取实际情况，得出最佳提取工艺为温度（X1）100，时间（X2）10.8 min，pH值（X3）10.46，将X1、X2、X3值代入回归方程，得出预测提取率为1.65%。2.3优选工艺条件验证试验取冰冻的猪十二指肠500 g共3份，分别按优选的最佳提取工艺条件：温度100，时间10.8 min，pH 值 10.46 进行提取酶解，称取糖肽粗品重量，并计算糖肽的提取率。试验结果显示，优化条件进 行 验 证 试 验 结 果 分 别 为 1.52%、1.40%、1.56%，平均值为1.49%，与回归方程的预测值相近，说明此提取工艺稳定。国外相关技术提取条件为100、15 min、pH值9.2，其粗品糖肽的提取率为 0.65%。本优化工艺糖肽的提取率比国外相关技术提取率高出100%。2.4糖肽检测将本优化工艺获取的粗品糖肽经纯化、磺化、再纯化，与GENTIUM公司的硫酸糖肽样品对比。研究结果显示，本优化工艺所得粗品糖肽经处理后获得的硫酸糖肽中总硫含量为 15.406%，属于较高水平，说明本优化工艺获得的粗品糖肽质量较高。3 结论与讨论 通过优化从猪十二指肠中提取糖肽工艺，结果发现糖肽最佳提取工艺为提取温度为100，提取时间为10.8 min，pH值10.46。碱解和酶解是影响糖肽提取的关键步骤，碱解前所用冰冻猪十二指肠应尽量粉碎，颗粒度越小，越有利于糖肽的提取，同时需要保证各试验中原料粉碎度相同，尽量减少其他因素对糖肽提取影响；碱解时在温度未达到设定值前，将提取液调至中性，减少试验误差。碱解产物应尽量去除丙酮，否则会影响酶的活性。参考文献1 牛海帆.度拉糖肽治疗2型糖尿病的临床效果分析 J.系统医学，2021，6（9）：51-53.2 张婧楷，刘潇璇，李莉莉.糖肽高分子材料及生物医学应用J.功能高分子学报，2021，34（5）：401-417.3 房晓雪.人参糖肽的结构鉴定、体内分布及其滴丸的制备研究D.长春：长春中医药大学，2021.4 丁霄霄.灵芝活性成分的制备及其残渣利用 D.南京：江苏大学，2019.5 陈露，陆震鸣，龚劲松，等.高压均质法提取云芝胞内糖肽J.食用菌学报，2017，24（2）：79-82.6 沈柱英，黄占旺，吴少福，等.响应面法优化纳豆菌糖肽超声提取工艺 J.中国食品学报，2014，14（7）：110-117.7 余晓斌，胡卫珍，濮文林.液体发酵法生产云芝胞内糖肽J.食品与生物技术学报，2006（1）：65-69.-120