基于肝癌细胞线粒体功能受损...肝癌细胞凋亡的作用机制研究_王侃.pdf

现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023doi:10.13241/ki.pmb.2023.02.008基于肝癌细胞线粒体功能受损和 caspase-3 信号通路探讨罗哌卡因促进肝癌细胞凋亡的作用机制研究*王侃1程志1吕刚飞2刘志飞3张蕾1刘星汝1（1 枣庄矿业集团中心医院检验科 山东 枣庄 277800；2 枣庄矿业集团中心医院肝病科 山东 枣庄 277800；3 山东省立医院病理科 山东 济南 250021）摘要 目的：基于肝癌细胞线粒体功能受损和天冬氨酸蛋白水解酶 3（caspase-3）信号通路探讨罗哌卡因促进肝癌细胞凋亡的作用机制。方法：选用细胞株人肝癌细胞 BEL-7402 进行实验研究。用不同浓度罗哌卡因处理 BEL-7402 细胞后，采用溴化噻唑蓝四氮唑（MTT）法检测肝癌细胞的增殖情况，光镜及 4，6-二苯胺-2-苯吲哚二盐酸盐（DAPI）溶液染色观察细胞形态，台盼蓝染色法测定细胞活力，流式细胞术分析 BEL-7402 细胞的凋亡情况，电子显微镜下观察细胞线粒体，激光共聚焦显微镜观察 caspase-3 在BEL-7402 细胞中的细胞核迁移情况，蛋白免疫印迹试验评价罗哌卡因对细胞质凋亡相关蛋白、线粒体凋亡相关蛋白、BEL-7402细胞和线粒体凋亡相关蛋白表达的影响。结果：罗哌卡因能够抑制肝癌细胞的生长，并呈剂量依赖性和时间依赖性。罗哌卡因可诱导 BEL-7402 细胞发生凋亡，显著增加 BEL-7402 细胞的凋亡率。罗哌卡因能够损伤肝癌细胞线粒体功能。激光共聚焦显微镜观察显示 caspase-3 分子迁移到细胞核。罗哌卡因与 caspase-3 相互作用，促进 caspase-3 向细胞核内迁移，刺激 caspase-3 和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP-1）、天冬氨酸蛋白水解酶 9（caspase-9）蛋白的表达，抑制 B 细胞淋巴瘤-2 基因（Bcl-2）的表达，促进凋亡酶激活因子（Apaf-1）的表达，促进线粒体释放细胞色素 C（Cytochrome C），激活 caspase-3 活性。结论：罗哌卡因具有促进肝癌细胞凋亡的作用，其作用机制可能与破坏肝癌细胞线粒体功能和激活 caspase-3 信号通路有关。关键词：罗哌卡因；肝癌细胞；线粒体；caspase-3；凋亡中图分类号：R-33；R735.7文献标识码：A文章编号：1673-6273（2023）02-244-07To Investigate the Mechanism of Ropivacaine Promoting Apoptosis ofHepatocellular Carcinoma Cells Based on Mitochondrial FunctionImpairment and Caspase-3 Signaling Pathway*WANG Kan1,CHENG Zhi1,L Gang-fei2,LIU Zhi-fei3,ZHANG Lei1,LIU Xing-ru1(1 Department of Clinical Laboratory,Central Hospital of Zaozhuang Mining Group,Zaozhuang,Shandong,277800,China;2 Department of Hepatology,Central Hospital of Zaozhuang Mining Group,Zaozhuang,Shandong,277800,China;3 Department of Pathology,Shandong Provincial Hospital,Jinan,Shandong,250021,China)ABSTRACT Objective:To explore the mechanism of ropivacaine promoting apoptosis of hepatoma carcinoma cell based onmitochondrial dysfunction and caspase-3 signaling pathway.Methods:Human hepatoma carcinoma cell line BEL-7402 was used forexperimental study.After Bel-7402 cells were treated with different concentrations of ropivacaine,the proliferation of hepatomacarcinoma cell was detected by MTT method,the cell morphology was observed by light microscopy and DAPI solution staining,the cellviability was determined by trypan blue staining,the apoptosis of Bel-7402 cells was analyzed by flow cytometry,and the mitochondriawere observed under electron microscopy.The nuclear migration of caspase-3 in Bel-7402 cells was observed by laser confocalmicroscopy,and the effects of ropivacaine on the expression of cytoplasmic apoptosis-related proteins,mitochondrial apoptosis-relatedproteins,Bel-7402 cells and mitochondrial apoptosis-related proteins were evaluated by western blot assay.Results:Ropivacaine caninhibit the growth of hepatoma carcinoma cell in a dose-dependent and time-dependent manner.The apoptosis of Bel-7402 cells wasinduced by ropivacaine,and the apoptosis rate of Bel-7402 cells was significantly increased.Ropivacaine can injure mitochondrialfunction of hepatoma carcinoma cells.Laser confocal microscopy showed the migration of caspase-3 molecules to the nucleus.Ropivacaine interacts with caspase-3 to promote the migration of caspase-3 into the nucleus,stimulate the expression of caspase-3,PARP-1 and caspase-9 proteins,inhibit the expression of Bcl-2,promote the expression of APAF-1,promote mitochondria to releaseCytochrome C and activate caspase-3 activity.Conclusion:Ropivacaine can promote the apoptosis of hepatoma carcinoma cell,and itsmechanism may be related to the destruction of mitochondrial function and activation of caspase-3 signaling pathway.Key words:Ropivacaine;Hepatoma carcinoma cell;Mitochondria;Caspase-3;ApoptosisChinese Library Classification(CLC):R-33;R735.7Document code:AArticle ID:1673-6273(2023)02-244-07*基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目（2017DX0355）作者简介：王侃（1983-），男，本科，主管技师，研究方向：肿瘤免疫，E-mall:（收稿日期：2022-05-23 接受日期：2022-06-18）244现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023前言原发性肝细胞癌近年来发病率逐渐上升，是常见的恶性肿瘤之一，发展迅速，是我国第 4 位常见恶性肿瘤及第 2 位肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命和健康，目前主要治疗方法有手术切除、化疗、介入治疗、消融治疗、肝移植等，但各种治疗方法均具有一定的局限性，治疗效果不尽人意1-3。局部麻醉药具有广泛的治疗功能，不仅具有镇痛和抗心律失常，同时可以预防或减轻急性疼痛、慢性疼痛和癌痛4,5。近年来部分研究显示，局部麻醉药具有一定的抗肿瘤作用，如罗哌卡因、利多卡因、布比卡因等能够有效降低肿瘤切除后复发和转移的风险6,7。局部麻醉药（如罗哌卡因）在一定浓度范围内可抑制细胞增殖、侵袭和迁移，抑制肿瘤细胞的增殖和转移，并促进细胞凋亡，且罗哌卡因能有效抑制特定浓度的肺癌细胞的侵袭性8,9。有研究显示局部麻醉药对肝癌细胞具有抗增殖和诱导凋亡的作用10，提示局部麻醉药可抑制肝癌细胞的生长。然而，罗哌卡因诱导肝癌细胞凋亡的潜在机制尚未完全阐明。因此，本研究通过观察罗哌卡因对人肝癌细胞 BEL-7402 增殖和凋亡的影响，探索罗哌卡因促进肝癌细胞凋亡的作用机制，以期为肝癌患者的局部麻醉治疗提供新的见解与策略。1 资料与方法1.1 细胞培养选用细胞株人肝癌细胞 BEL-7402 进行实验研究，购于上海欧易生物医学科技有限公司。将细胞培养于含含 10%胎牛血清的 RPMI-160 培养基中，并置于 37、5%的 CO2培养箱中培养。1.2 MTT 法检测细胞增殖利用溴化噻唑蓝四氮唑（MTT，上海前尘生物科技有限公司）法检测细胞增殖。制成 1.5104 L-1的 BEL-7402 细胞悬液，接种于 96 孔板，在 RPMI-1640 培养基中添加 10%胎牛血清，并置于 37、5%的 CO2培养箱中培养 48 h，然后用不同浓度的罗哌卡因处理（0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0mmol/L 和 4.0 mmol/L）24 h、48 h 和 72 h。以不加罗哌卡因处理为空白对照组。然后采用 MTT 法检测肝癌细胞的增殖情况。1.3 镜检观察细胞形态，DAPI 染色细胞核将 BEL-7402 细胞以每孔 2.0104个细胞置于 24 孔板中。在含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中培养 48 h，置于37、5%的 CO2培养箱中培养，然后用 0.5 mmol/L、1.0 mmol/L或 2.0 mmol/L 罗哌卡因处理。处理 48 h 后，光镜下观察细胞形态，用 4，6-二苯胺-2-苯吲哚二盐酸盐（DAPI）溶液染色。细胞在 100 倍的荧光显微镜下成像。1.4 台盼蓝染色法测定细胞活力和代谢活性为测定细胞活力，将 BEL-7402 细胞以每孔 2.5104个细胞接种于 6 孔板，在含 10%胎牛血