基于芦荟皮层外泌体样囊泡的创面修复作用_曾鲁鹏.pdf

第 卷第期 年 月福建医科大学学报 基于芦荟皮层外泌体样囊泡的创面修复作用曾鲁鹏，王华英，施婉华，李春艳，陈敬华摘要：目的研究芦荟皮层外泌体样囊泡（）在创面修复中的作用。方法通过激光共聚焦成像和流式细胞分析验证 被细胞摄取的可行性。通过自由基清除及细胞内活性氧水平测定实验，验证 的抗氧化作用。采用划痕和 实验验证 对细胞迁移的影响。构建小鼠全层皮肤切除模型，将 作用于创面，验证其对创面的修复作用。结果 可经由巨胞饮和膜融合等多种途径被人永生化表皮细胞摄取，具有良好的阳离子自由基及活性氧清除作用，可有效促进细胞增殖和迁移，将其应用于小鼠创面模型治疗 后，创面修复率达 。结论 可促进创面愈合疗效，有望成为一种经济、有效、安全的新型绿色药物。关键词：芦荟皮层外泌体样囊泡；抗氧化；细胞增殖和迁移；创面愈合文献标志码：文章编号：（）收稿日期：资助项目：福建省科技创新联合资金项目（）作者单位：福建医科大学 药学院，福州 作者简介：曾鲁鹏，女，医学博士通信作者：陈敬华 ：术后伤口愈合问题一直是临床治疗中关注的焦点。近年来，为提升伤口愈合效率，研究者们开发了多种治疗剂应用于伤口修复。外泌体作为一种新型的纳米 治 疗 剂，在 促 进 伤 口 愈 合 研 究 中 广 受 关注，但其产量低、生产成本高、难以批量生产，在临床应用具有局限性。植物源性外泌体样囊泡在生产成本、获取产量及操作简便性中具有较大优势，有望成为替代外泌体的理想分子。等的研究表明，芦荟皮层外泌体样囊泡（，）富含多种具有抗炎、抗氧化及抗菌活性的脂质和生物活性成分，可能在缓解伤口愈合过程中的炎症反应、预防伤口感染、促进创面修复中具有积极作用。研究 在促创面愈合中的疗效，可能成为开发新型创面修复纳米制剂的新选择。笔者拟以 为纳米治疗剂，对其抗氧化活性及促细胞增殖、迁移活性进行验证，考察其对小鼠全层皮肤切除创面的治疗效果，探究其促创面修复性能（图），以期为创面修复提供一种经济、安全、有效的药物。材料与方法 试剂与仪器 试剂阳离子自由基产生剂 联氮双（乙基苯并噻唑啉磺酸）二铵盐，北京雷根生物技术有限公司；过硫酸钾（，上海立菲生物有限公司）；胰酶（上海立菲生物有限公司）；磷酸盐缓冲溶液（，上海立菲生物有限公司）；细胞培养基（江苏凯基生物技术股份有限公司）；内皮细胞培养基（上海中乔新舟生物科技有限公司）；细胞膜绿色荧 光 染 料（，苏州宇恒生物科技有限公司）；细胞核染料（，北京索莱宝科技有限公司）；氯丙嗪（，上海麦克林生化科技有限公司）；阿米洛利（，上海麦克林生化科技有限公司）；奥美拉唑（，上海源叶生物科技有限公司）；菲律宾菌素（美国 公司）；活性氧检测试剂盒（上海碧云天生物试剂有限公司）。仪器紫外分光光度计（，美国 公司）；细胞培养箱 立德泰勀（上海）科学仪器有限公司；激光扫描共聚焦显微镜（型）；流式细胞仪 （），美国 公司；超声波细胞粉碎机（，江苏恒敏仪器制造有限公司）；恒温混匀仪（无锡沃信仪器 有 限 公 司）；酶 标 仪（，美国赛默飞世尔科技有限公司）；脱色摇床（北京六一生物科技有限公司）；倒置荧光显微镜（，上海点应光学仪器有限公司）。细胞与动物人永生化表皮细胞（，）、人脐静脉内皮 细 胞（，）均由中国科学院细胞库提供；实验模型鼠 雄鼠 上 海 斯 莱 克 实 验 动 物 有 限 公 司，许可证号：（沪）。方法 的分离提取新鲜芦荟（由福建医科大学天然药物化学系张永红教授鉴定，品种为中华芦荟）经蒸馏水充分清洗次后，以 清洗次，分离芦荟皮层和凝胶，切成小块，分别置于榨汁机中，加入适量 溶液，运行榨汁机 ，获福建医科大学学报 年 ：芦荟皮层外泌体样囊泡；：联氮双（乙基苯并噻唑啉磺酸）二铵盐。图 促创面修复研究示意图 得芦荟皮及凝胶汁液，经尼龙纱布过滤后，利用差速离心法在将芦荟汁 离心 ，离心 ，离心 ，通过多次离心分离除去芦荟残渣、细胞碎片、杂蛋白等污染物，离心 获得 沉淀。加入适量 重悬，并清洗沉淀。再次经 离心获得沉淀。以少量预冷 溶液重悬，经 蛋白定量试剂盒对所得的 的蛋白进行定量。确定蛋白浓度后，保存。的表征采用适量无菌的 将 稀释至适当浓度后注入纳米粒子追踪分析系统（，）中，在 下录制个 的视频，每个视野下 个粒子。采用 分析软件分析 的粒径大小。同时采用动态光散射法（，）表征 的粒径分布情况。样品以 的比例经 稀释后，置于样品池中，利用激光粒度仪（）在 激光二级管灯作用下，于 处收集散射光，测量 的粒径分布。此外，经 溶液配制成 待测溶液，置于电位样品池中，利用电位分析仪测定 的电位分布情况。形貌和分散性表征分别利用透射电子显微 镜 成 像（，）和原子力显微镜成像（，）表征囊泡的形貌和分散情况。取样品 滴于封口膜上，将铜网（覆有 孔碳支持膜）覆盖于样品液滴上，室温孵育 后，将铜网转移至多聚甲醛液滴上，固定 后经蒸馏水清洗，滤纸吸干后，将铜网转移至醋酸双氧铀液滴（值）上，负染 后用滤纸吸干铜网上残余的染液，置于铜网盒中晾干，下观察。将 以多聚甲醛溶液稀释 倍，充分涡旋混匀后，滴于云母上反应 ，置于 下观察。细 胞 对 的 摄 取 机 制 研 究将 细胞以 个孔的密度接种于孔板内，置于、体积分数为 的 细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，分别加入氯丙嗪、菲律宾菌素、阿米洛利、奥美拉唑 种抑制剂处理细胞作为实验组，同时设置空白组和对照组。实验组经不同抑制剂处理后，加入含绿色荧光标记的芦荟皮层外泌体样囊泡（）的细胞培养液，孵育 后，使用胰酶消化细胞，经 离心 ，用 清洗次后，以 的 重悬置于流式管中，通过流式细胞仪对各给药组细胞摄取 的情况进行定量检测及对比。第期曾鲁鹏，等：基于芦荟皮层外泌体样囊泡的创面修复作用 的抗氧化活性研究 对 自由基的清除作用配制 过硫酸钾溶液（）用于溶解 的 粉末，使其终浓度为 ，过夜反应。将不同浓度 （、和）与 的 溶液混合，于 中反应 ，通过紫外分光光度计记录其光谱变化情况，并记录 处的紫外吸收，计算 对 自由基的清除率：清除率（）（紫外吸收值空白组紫外吸收值实验组）紫外吸收值空白组 抑制细胞内活性氧生成的作用研究分别设置空白组、实验组和对照组，其中对照组以含血清的培养基培养，实验组以不同蛋白浓度的 溶液（、和 ）作用于 细胞，孵育 后，以 清洗细胞 次，加入以无血清培养基配制的 溶液，孵育 后，清洗细胞。实验组和对照组均加入含 的细胞培养液，构建细胞氧化应激模型。孵育 后吸弃培养液，清洗次后消化细胞并清洗，以 的 重悬细胞并置于流式管中，通过 对每组的 荧光情况进行定量检测及对比。对照组和实验组相对于空白组的 荧光强度计算公式如下：相对 荧光强度（荧光强度各组荧光强度空白组）对细胞增殖的作用研究 和 接种于 孔板内（个孔），培养至细胞贴壁后，吸弃培养液，以 清洗次，以低血清培养液（，双抗）配制质量浓度为、和 的芦荟皮浆液和 溶 液（蛋 白 浓 度 为、和 ），每孔 、培养箱孵育 后，以 法验证各组细胞的增殖情况：细胞增殖率（）（实验组 溶剂）（对照组 溶剂）（对照组 溶剂）促细胞迁移作用研究 划痕实验 细胞种于孔板内（个孔），待细胞在孔板底部铺满一层后，吸弃培养液，以 枪头垂直于孔板划出一条中线，清洗次，制成细胞划痕，以蛋白浓度、和 给药，分别孵育、，显微镜下观察并拍摄记录细胞迁移情况，软件拟合细胞迁移间距，计算闭合率：闭合率（）（初始间距给药 后间距）初始间距 实验 细胞以无血清培养基重悬，接种于 孔板的 小室内（个孔），下室加入以 培养基配制的 溶 液，蛋 白 浓 度 分 别 为 、和 ，孵育 后，取出小室经 清洗次后，多聚甲醛固定 ，后以 结晶紫染液染色 ，用棉签轻轻擦去上室中未迁移的细胞，再用 清洗次。倒置荧光显微镜下随机取个视野观察细胞，并计数。细胞迁移率（）（实验组迁移数对照组迁移数）对照组迁移数 促创面愈合研究选用 周龄的 雄鼠，脱毛处理 后，麻醉小鼠，使用手术器械（剪刀和圆刀片）构建 大小的全层皮肤切除创面，生理盐水清洗次。拍照记录创面初始状态，使用 软件拟合创面初始面积。将 只小鼠随机分为对照组（无菌 ）和实验组 （），每组 只。各组均以滴涂方式给药（每天次），含有药物的液滴覆盖创面及其边缘皮肤区域，同步给药 后，将创面部位按照初始面积取下，置于组织固定液中，留待进行病理切片和免疫组织化学分析。治疗过程中同步记录创面变化情况，拟合创面面积以计算愈合率：创面愈合率（）（第天初始创面面积第天创面面积）第天初始创面面积 统计学处理实验至少重复次，以表示。使用双尾配对检验评估组间统计学差异。为差别有统计学意义。结果 的表征采用 和 表征所得 的形貌，透射电镜下 呈明显的脂质双 分 子 层 结 构，多 为 碟 状 或 茶 托 状，粒 径 ，与文献报道的外泌体及植物外泌体样囊泡形貌及大小相近（图）。进一步通过 分析发现，囊泡呈明显的圆形纳米结构，分散性好，粒径均一（图）。采用纳米颗粒跟踪分析技术分析 的尺寸分布，优化条件后的 总体尺寸分布在 ，其主峰位于 ，分析所得 囊 泡 尺 寸 与、等 结 果 基 本 一 致，的个数浓度为 ，符合用药需求（图）。细胞对 的摄取机制研究采用氯丙嗪、菲律宾菌素、阿米洛利、奥美拉唑种抑制剂分别作用于网格蛋白介导的内吞、陷窝蛋白依赖的内吞、巨胞饮和膜融合种摄取途径。与空白组比较，福建医科大学学报 年 ：芦荟皮层外泌体样囊泡；：透射电子显微镜成像；：原子力显微镜成像。：的 图；：的；：的纳米粒子追踪分析图。图 的形貌及粒径表征 处理组的荧光递增，在多种抑制剂作用下，细胞内 的荧光明显降低（图）。对各组的荧光强度进行定量，发现以上种抑制剂均可有效抑制细胞对 的摄取，抑制率分别为 、和 ，与未经抑制剂干预的 处理组间的差别具有统计学意义（，图）。：绿 色 荧 光 标 记 的 芦 荟 皮 层 外 泌 体 样 囊 泡；：氯丙嗪；：菲律宾菌素；：阿米洛利；：奥美拉唑；：流式细胞仪；：人永生化表皮细胞。图 表征种抑制剂对 细胞摄取 的影响 的抗氧化活性研究 对 自由基的清除作用研究为探究 的抗氧化活性，采用 自由基清除实验进行测定。可被氧化，生成蓝绿色的自由基阳离子 ，当抗氧化剂存在时，可将蓝色的 转为无色的 ，并导致其在 处吸光度降低（图）。与 反应后，其吸光度明显降低，且呈 浓 ：人永生化表皮细胞；：细胞膜绿色荧光染料；：芦荟皮层外泌体样囊泡。：绿色荧光标记的芦荟皮层外泌体样囊泡（）；：氯丙嗪处理组；：菲律宾菌素处理组；：阿米洛利处理组；：奥美拉唑处理组。与组比较，：。图种细胞抑制剂对 摄取 的定量分析 度依赖性，个数浓度为 时对 的清除率可达 （图）。抑制细胞内活性氧（，）生成的作用研究为考察 对细胞内 生成的抑制作用，利用 构建细胞氧化应激模型，结合 荧光探针，发现在作 用 下 细 胞 内 产 生 大 量 ，将 细 胞 内 氧化成 ，于 激光下呈现明显的绿色荧光（对照组）（图）。而经 预处理的细胞 内 水 平 明 显 下 降，作 用 下 所 致 氧化的荧光信号低于对照组，且呈现一定浓度的依赖性。对各组荧光进行定量，不经 处理（空白组）的细胞内的荧光明显低于对照组，差别具有统计学意义（）；在 作用下荧光强度逐渐降低，当 蛋白浓度为 时，其荧光强度相对于对照组减弱了 （图）。第期曾鲁鹏，等：基于芦荟皮层外泌体样囊泡的创面修复作用 ：联氮双（乙基苯并噻唑啉磺酸）二铵盐。图 自由基形成机制图 ：芦荟皮层外泌体样囊泡；：联氮双（乙基苯并噻唑啉磺酸）二铵盐。：与 反应紫外吸收光谱图；：对阳离子自由基的清除率。图 的氧自由基清除性能 ：芦荟皮层外泌体样囊泡；：绿色荧光探针；：活性氧；：过氧化氢；：空白组；：流式细胞仪。：分析 对 生成的抑制作用；：各组 生成情况定量。与对照组比较，：。图 抑制细胞内 生成的作用 对 细 胞 增 殖 的 作 用 研 究为 验 证 在 创 面 愈 合 过 程 中 的 作 用，本 研 究 利 用 比色法分别考察了 及芦荟皮层浆液作用后 细胞和 细胞的增殖情况。可 有 效 促 使 细 胞 增 殖，且