基于网络药理学和分子对接探...射液对有机磷中毒的作用机制_林淑瑜.pdf

药理基于网络药理学和分子对接探索血必净注射液对有机磷中毒的作用机制林淑瑜，林 冠，戴 立，王佳坤（中国人民解放军联勤保障部队第 医院药剂科，福建泉州）摘要：目的 基于网络药理学和分子对接探索血必净（）治疗有机磷中毒的生物活性化合物和潜在的作用机制。方法检索论文获得 的有效成分，在中药系统药理学数据库与分析平台（）中筛选各有效成分的作用靶点；再从 数据库获取治疗有机磷中毒疾病的相关靶点；应用 .软件取 有效成分的相关靶点与有机磷中毒疾病靶点的交集，获取 治疗有机磷中毒的潜在靶点；利用 数据库来获得潜在靶点的蛋白相互作用关系，使用 .软件进行拓扑分析并筛选 治疗有机磷中毒的关键靶点；通过 数据库对潜在靶点进行 功能富集分析和 通路富集分析，并使用 .软件构建药物成分靶点与疾病治疗通路的网络图；中 值排名前 的活性成分黄芩素、木犀草素、槲皮素为配体，与 排名前 的关键靶点蛋白为受体，用 对配体和受体进行分子对接及结果可视化。结果 共筛选出血必净注射液中 种中药成分的有效成分相关靶点 个，有机磷中毒相关靶点 个，获得潜在共表达靶点 个，拓扑分析发现 种关键成分和 个潜在关键靶点；富集分析筛选出 个条目，涉及生物过程个，细胞组成 个，分子功能 个；通路富集分析得到 条通路；分子对接发现受体分子与配体分子之间能很好的结合。结论血必净注射液主要是通过活性成分黄芩素、木犀草素、槲皮素等作用于、等相关靶点，多成分、多靶点、多途径参与有机磷中毒治疗作用。关键词：血必净注射液；网络药理学；有机磷农药中毒；分子对接技术；作用机制中图分类号：文献标识码：文章编号：（）作者简介：林淑瑜，女（）。学历：硕士学位。职称：主管药师。从事医院药物治疗的研究。通讯作者：王佳坤，男（）。职称：药剂科主任。从事医院药学管理及临床药学的研究。基金项目：泉州科技计划项目（）基金 ，（.，.，）：.，.，.，.，（）（），.“”.；.，.；.，.，.：；急性有机磷中毒（，）是我国急诊科常见急重症，因大剂量误服、自服或长期接触有机磷农药而发生急性中毒，具有发病速度快、病情变化快、死亡率高的特点，尽管在临床治疗中广泛使用解毒剂，但中毒导致的死亡率仍高达 。急性有机磷中毒可导致急性胆碱能功能障碍、肌肉无力、癫痫发作、昏迷和呼吸衰竭。其中毒机制为抑制乙酰胆碱酯酶导致乙酰胆碱的堆积，刺激烟碱型和毒蕈碱型乙酰胆碱受体以及肾上腺素受体，引起中枢和外周神经系统严重的功能损伤。呼吸麻痹和心脏骤停被认为是急性有机磷中毒患者最常见的死亡原因。有研究表明，急性中毒治疗后，仍然会存在长期的后遗症，如中枢和周围神经系统的异常持续长达 年，其机制尚不清楚。血必净注射液是由五种中草药分别是红花、丹参、川芎、当归、赤芍组成，含有约 种生物活性化合物，如羟基红花黄、丹参酚、阿魏酸、芍药苷、番泻叶内酯 等更多成分，具有活血化瘀、疏通脉络、溃散毒邪、消除内毒素的功能，与抗生素联合使用治疗脓毒症具有显著的协同作用，能改善临床症状，显着降低病死率。血必净注射液临床上广泛应用于在脓毒症，和多器官功能障碍综合征，涉及多种危重病。近几年来，国内许多研究报道了血必净注射液联合血液灌流能提高重度有机磷中毒的救治，减轻大量乙酰胆碱堆积，并能与碘解磷定协同作用，缩短患者机体恢复时间，维护心肌功能，减少并发症。血必净注射液是由多种成分组成的复方中药注射剂，许多研究表明，其可通过“多成分多靶点多通路”作用机制发挥药理作用，对有机磷中毒患者的临床治疗效果确切，但其对有机磷中毒的治疗机制尚不明确。因此，本文通过网络药理学方法探究血必净注射液治疗有机磷中毒的作用机制，并采用分子对接技术验证研究结果的可靠性。资料与方法.网络药理学研究的软件与数据库文章所用的在线数据库及其网址（见表），.为网络分析软件，选择 为分子对接和结果可视化软件。.血必净注射液有效成分的筛选及靶点收集利用中药系统药理学数据库与分析平台（）检索获取红花、丹参、川芎、当归、赤芍的化学成分，以“（）”和“（）”.为条件进行筛选，获取主要有效成分以及对应的作用靶点。采用 数据库将靶点信息转化为标准基因名。表 网络药理学研究的在线数据库数据库名称网址：.：.：.：.：.：.：.微生信在线平台：.有机磷中毒靶点收集以及潜在治疗靶点获取采用人类基因数据库（），以“”为关键词搜索，获得有机磷中毒的相关靶点。利用.在线平台绘制药物与疾病交集韦恩图，获得血必净注射液成分的相关靶点和有机磷中毒相关靶点的交集靶点，即为血必净注射液治疗有机磷中毒的潜在治疗靶点。.蛋白蛋白相互作用的网络构建（）及关键治疗靶点获取 在 数据库中导入血必净注射液治疗有机磷中毒的潜在治疗靶点，物种设置为“”，获得潜在靶点蛋白相互作用 关系图。将蛋白相互作用关系结果导入.软件构建进行网络拓扑分析，根据 值排名筛选血必净有效成分治疗有机磷中毒的关键靶点。.和 通路富集分析将潜在治疗靶点导入 数据库，物种设置为“”，分别进行生物过程（）、细胞组成（）、分子功能（）和 通路富集分析，并以 .，最小计数为 且富集因子 .为条件进行筛选分析，选取 值前 的通路做条形图，使用微生信在线工具绘制 富集分析气泡图。.“活性成分潜在靶点通路疾病”网络构建根据“.”取得的血必净治疗有机磷中毒的潜在治疗靶点筛选出对应血必净注射液的活性成分，选取 值排前 条的通路及对应的潜在靶点，使用 .构建血必净注射液治疗有机磷中毒的“活性成分潜在靶点通路疾病”网络图。.药物活性分子与潜在治疗靶点蛋白对接选取 值排名前 的潜在治疗靶点为受体蛋白，值排名前 海峡药学 年 第 卷 第 期位药物活性成分为配体小分子；并选择度值排名前 位的药物活性成分为受体作对接。采用 数据库下载配体小分子 结构，保存为 格式文件，导入 软件构建成 结构，在 数据库中下载受体蛋白的 晶体结构，保存为 格式文件。使用 软件对配体和受体进行分子对接。结果.血必净主要活性成分及靶点筛选结果 通过 数据库检索血必净注射液中的 种组分：红花、丹参、当归、川芎、赤芍，共收集到化合物成分 个（个共有成分），其中红花 个、丹参 个、当归 个、川芎 个、赤芍 个。在 数据库中查找各成分对应靶点，共收集化合物靶点 个，整合重复靶点后共获取 个药物靶点，其中有 个共表达靶点（见图），再将药物靶点在 数据库中转换为标准基因名称。图 红花、丹参、当归、川芎及赤芍五种成分对应的药物靶点注：红花；：丹参；：当归；：川芎；：赤芍.血必净注射液治疗有机磷中毒的潜在靶点以“”为关键词在 数据库中检索出有机磷中毒治疗靶点 个。采用 .在线软件对血必净注射液 个基因靶点和有机磷中毒的 个靶点做交集，获取 个潜在治疗靶点（见图）。将这些靶点导入 数据库得到蛋白相互关系 网络图（见图），将蛋白相互关系分析结果导入 .软件中进行拓扑异构学分析，选取 排名前 的基因（见表）。图 血必净注射液与有机磷中毒的靶点韦恩图表 值排名前 的药物疾病共表达基因拓扑分析序号基因名称蛋白名称（）.构建“药物成分靶点”网络图运用 .软件构建“药物成分靶点”网络图（见图）。通过血必净注射液中的各组分化合物成分的 进行分析，筛选 排名前 的化合物成分作为治疗有机磷中毒的活性成分，见表。.和 富集分析在 数据库中选择“”导入 个潜在治疗靶点，物种选择“.”，设置 .，.。富集分析筛选出条目 条，包括生物过程（）条，主要与腺体发育、凋亡信号通路的调控、细胞成分运动的正向调节、结合转录因子活性的调节、细胞群增殖的负调控、活性氧代谢过程的调节、对无机物、异种刺激、辐射、激素、调节细胞对压力、氧气水平降低、有毒物质、生长因子、酒精、细胞外刺激等功能有关；细胞组成（）条，膜筏、囊泡腔、线粒体外膜、蛋白质 复合物、受体复合物、富含 的颗粒管腔、神经元细胞体转录调节复合物、突触后膜、细胞外基质、内吞囊泡膜、粘着斑、细胞器包膜腔等有 .关；分子功能（）条，与蛋白质同二聚化活性、激酶结合、结合转录因子结合、磷酸酶结合、血红素结合、细胞因子活性、蛋白质结构域特异性结合、一氧化氮合酶调节剂活性、脂质结合、蛋白丝氨酸 苏氨酸激酶活性、抗氧化活性等有关。将 .且排名前 的、通过微生信平台作气泡图（见图）。图 网络图表 血必净注射液中活性成分 值排名成分名中文名来源中药黄芩素赤芍、丹参、红花木犀草素丹参、红花槲皮素红花脱氢丹参酮丹参胡萝卜素红花（）（）儿茶素赤芍谷甾醇赤芍、当归、红花山柰酚红花 鞣花酸赤芍羟基山奈酚红花 通路富集分析，共筛选出 条信号通路（.），选择 值排名前 的通路做条形图（见图），主要有癌症的途径、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌活性氧、前列腺癌、膀胱癌、铂类药物耐药性、信号通路、信号通路、利什曼病、类风湿关节炎、癌症中的转录失调、胰岛素信号通路、糖尿病性心肌病、羟色胺能突触、化学致癌 加合物、信号通路、坏死性凋亡、胆碱能突触、多巴胺能突触、神经活性配体受体相互作用等通路。.活性成分靶点通路疾病网络图的构建运用 .软件将药物活性成分、交集靶点、值排名前 的通路、疾病治疗靶点构建“活性成分靶点通路疾病”网络图（见图）。个潜在治疗靶点对应红花活性成分 个，丹参活性成分 个，川芎活性成分 个，当归活性成分 个，赤芍活性成分 个，含红花和丹参、当归、赤芍共同成分 个。结果显示，网络中共有 个节点，条边。海峡药学 年 第 卷 第 期图 药物化合物靶点网络图注：蓝绿色圈：药物靶点基因；绿色圈（）：丹参活性成分；蓝色圈（）：红花活性成分；蓝色圈（）：赤芍活性成分；紫色圈（）：川芎活性成分；粉色（）：丹参、当归、赤芍、与红花共有成分，、为当归（）活性成分；深绿色：川芎与赤芍共有成分.活性成分与关键治疗靶点分子对接预测将 排名前 的关键靶点蛋白（见表）为受体分子，分别与血必净注射液中 值较高的活性成分黄芩素、木犀草素、槲皮素为配体小分子，运行 软件进行分子对接，结果见图 。结合能评判小分子与蛋白的相互作用强度，结合能越低，表明两者结合越稳定，小分子与蛋白的最低结合能.，说明药物成分与靶点具有强结合力。分子对接的结果显示：活性成分黄芩素与关键靶点与表皮生长因子受体（）、表皮生长因子（）、丝裂原激活蛋白激酶（）、血红素加氧酶（）、抑癌基因（）、丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶（）、血管内皮生长因子（）的结合能.，可很好的对接结合；槲皮素可与、很好对接；木犀草素与、重组人白介素（）、原癌基因蛋白（）也能很好的结合。讨论急性有机磷农药中毒是急诊医学常见却又复杂而高死亡率的病症，引起有机磷中毒的主要机制是有机磷对胆碱酯酶的抑制作用，导致体内乙酰胆碱在组织中大量的堆积，从而引起一系列的神经系统、心血管系统、呼吸系统的功能障碍，严重的胆碱能危象引起的多器官功能障碍综合征是导致患者死亡的主要原因。临床上治疗主要通过复苏、洗胃、静脉注射阿托品和碘解磷定，必要时进行血液灌流等治疗方式，临床上也急需要更多更有效的治疗方法来抢救病人。血必净注射液是由红花、丹参、当归、川芎、赤芍 种中草药中提取，在国内临床广泛的应用于重症肺炎及脓毒血症，尤其在武汉 疫情时，国家卫健委纳入到新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四至七版），。在这之前，国内许多研究报道血必净注射液应用于有机磷中毒患者，认为可能的机制与拮抗促炎因子有关，并可缩短胆碱酯酶复活时间。黄破等人对血必净注射液治疗急性有机磷农药中毒进行了系统评价和荟萃分析，分析结果显示血必净注射液治疗急性有机磷农药中毒患者具有显著的临床疗效，最有效的剂量是 次 ，日 次。为进一步的了解血必净注射液治疗有机磷中毒的作用机制，本研究运用网络药理学和分子对接技术探讨其相关的作用机制。.通过 数据库筛选得到到血必净注射液的化合物成分 个（个共有成分），化合物靶点 个，整合重复靶点后共获取 个药物靶点，其中有 个共表达靶点。其中与有机磷中毒疾病共表达靶点数有 个，如、等，这些靶点主要集中在炎症反应、细胞凋亡、拮抗内毒素、血管内皮保护、抗氧化应激等病理过程。人体有一个神经元胆碱能系统，该系统包括乙酰胆碱、胆碱乙酰转移酶、囊泡、囊泡 转运蛋白、胆碱转运蛋白、毒蕈碱和烟碱组成