基于网络药理学和分子对接探...斛合剂治疗糖尿病的作用机制_陈涛.pdf

福建中医药 2023 年 1 月 第 54 卷 第 1 期Fujian Journal of TCM January 2023，54（1）基于网络药理学和分子对接探讨石斛合剂治疗糖尿病的作用机制陈涛1，朱铭星2，林诗铃1，陈剑钰1，张捷平3，施红3，黄鸣清1，郑燕芳1*（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；3.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）摘要：目的 运用网络药理学方法探讨石斛合剂治疗糖尿病的作用机制。方法 运用 TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM数据库及文献报道搜集石斛合剂中的化学成分，并以PharmMapper平台预测化学成分靶点；运用GeneCards、TTD、OMIM、DrugBank筛选糖尿病相关靶点，将获取的化学成分靶点与糖尿病相关靶点取交集得到石斛合剂与糖尿病的共同靶点；利用STRING平台对交集靶点进行PPI网络构建，筛选出核心靶点；利用DAVID数据库对交集靶点进行KEGG富集分析与GO富集分析，应用微生信平台绘图；应用Cytoscape 3.7.2软件构建石斛合剂治疗糖尿病的成分-靶点-通路网络关系图；最后利用 AutoDock软件进行分子对接验证。结果 从石斛合剂中筛选得到199种活性成分，对应291种潜在靶点。石斛合剂抗糖尿病的核心成分39个，包括表小檗碱、新隐丹参酮、小檗红碱等，核心靶点14个，包括ALB、Akt1、IGF1、EGFR、PPARG、ESR1等。GO富集分析得到179个生物过程（BP）、58个分子功能（MF）、16个细胞成分（CC），主要涉及凋亡过程的负调控、类固醇激素介导的信号通路、细胞对胰岛素的刺激反应等生物学进程；KEGG通路分析得到信号通路80条，包括FoxO信号通路、胰岛素信号通路、PI3K/Akt信号通路等。结论 石斛合剂抗糖尿病具有多成分、多靶点、多通路的作用特点，其可能通过降低胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，促进糖脂代谢等途径发挥治疗糖尿病的作用，同时可能对糖尿病脑病等并发症起到干预作用。关键词：糖尿病；石斛合剂；网络药理学；分子对接；作用机制糖尿病患者以慢性高血糖为特征，继发引起机体组织、细胞损伤1。石斛合剂是福建中医药大学施红教授通过长期临床实践总结制定，并已成为福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂，由石斛、知母、黄芪、丹参、葛根、黄连、五味子、地龙、蒲公英、大黄等药物组成，具有清热、活血、祛毒之功效。前期临床和基础研究表明，石斛合剂治疗糖尿病及其并发症具有显著疗效，其作用可能与促进胰岛细胞增殖、保护神经系统等有关2-3。但由于石斛合剂成分复杂，很难从整体水平系统阐明其治疗糖尿病及其并发症的作用机制。网络药理学可通过“多成分-多靶点-多通路”模型显示药物和机体之间的联系，以整体性与系统性为特性，符合中医的整体观念4。故本研究利用网络药理学方法，挖掘石斛合剂在治疗糖尿病及其并发症中潜在的有效成分和作用机制。1方法1.1石斛合剂化学成分收集及潜在靶点预测基于中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：/www.tcmsp- ADME 筛选条件。同时通过BATMAN-TCM数据库（http：/bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、ETCM 数据库（http：/ 等网站对已有文献进行检索，筛选出同为石斛合剂的潜在活性成分作为补充。将石斛合剂活性成分整理去重后，通过 PubChem 平台（https：/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取石斛合剂潜在活性成分的 2D 结构式，置入 PharmMapper 平台（http：/www.lilab- UniProt数据库（https：/www.uniprot.org/）标准化靶点名称。1.2糖尿病潜在作用靶点筛选及药物-疾病共同作用靶点获取以“Diabetes Mellitus”作为关键词，在 GeneCards 数据库（https：/www.genecards.org/）检索糖尿病相关靶点，将靶点的相关系数9.0为卡值，同时通过 TTD 数据库（http：/ 数据库（https：/www.omim.org/）、DrugBank 数据库（https：/ STRING 平台收稿日期：2021-12-08基金项目：国家自然科学基金项目（81703909，81973827）；福建省自然科学基金项目（2020J01728，2020J01719）通信作者：郑燕芳，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0101242陈涛 等：基于网络药理学和分子对接探讨石斛合剂治疗糖尿病的作用机制第 1 期（https：/cn.string-db.org/）构建 PPI 蛋白互作网络，利用Cytoscape 3.7.2软件进行PPI网络图的绘制。1.4GO富集分析与KEGG通路分析利用DAVID平台对石斛合剂-糖尿病的交集靶点进行GO富集分析与KEGG通路分析，将富集分析结果利用微生信网站（http：/ KEGG 富集分析得到的通路信息通过Cytoscape 3.7.2软件构建成分-靶点-通路的网络图，对网络图进行拓扑分析，分析石斛合剂作用于糖尿病的主要活性成分。1.6活性成分与靶点分子对接验证从 PubChem数据库下载主要活性成分的 3D 结构文件，利用OpenBabel-2.4.1 软件将其转化为 MOL2 格式文件。选定PPI网络核心关键靶点，从PDB数据库下载核心靶点蛋白的PDB格式文件，再利用PyMol软件对其进行去除配体和水分子等操作。最后将得到的成分文件和靶点文件利用 AutoDockTools 1.5.6 和AutoDock Vina 软件进行分子对接，结合能越低，表示结合活性越强，通常认为结合能0 kcal/mol 提示分子之间具有结合活性，-5.0 kcal/mol提示分子之间具有较强的结合活性5。利用PyMol软件进行可视化分析。2结果2.1石斛合剂的活性化合物筛选及靶点预测通过TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM数据库进行检索，同时检索文献对化学成分进行补充，最后共得到总有效成分 199 个，通过 PharmMapper 平台进行靶点预测，通过UniProt数据库统一规范靶点名，删除重复值，得到活性成分潜在靶点共291个。石斛合剂药物对应的潜在活性成分及靶点数目，见表1。2.2糖尿病有关靶点预测通过GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 数据库获取糖尿病潜在疾病靶点1 030个。将药材与疾病靶点映射后，获得74个石斛合剂抗糖尿病的潜在作用靶点，绘制韦恩图，见图1。2.3构建PPI网络经STRING平台获取石斛合剂抗糖尿病作用靶点的相互作用关系，通过 Cytoscape 3.7.2制作网络图，如图 2所示。包括 73个节点与551条边，按照度值从大到小排序，以度值、介数、紧密度的平均数为条件，筛选 PPI 网络图的核心靶点，共获得14个核心靶点，包含白蛋白（ALB）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（Akt1）、促生长因子（IGF1）、表皮生长因子受体（EGFR）、过氧化物酶体增生激活受体 （PPARG）、雌激素受体 （ESR1）、过氧化物酶体增生激活受体 （PPARA）、内皮一氧化氮合成酶（NOS3）、丝裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）、血管紧张素转换酶（ACE）等，推测其在石斛合剂治疗糖尿病中具有重要地位。2.4GO 功能富集分析利用 DAVID 数据库对靶点进行 GO 富集分析（P0.05），其中，生物过程（BP）相关条目179条，生物过程主要涉及凋亡过程的负调控、类固醇激素介导的信号通路、细胞对胰岛素的刺激反应等生物过程；分子功能（MF）相关表1石斛合剂“中药-活性成分-潜在靶点”信息中药大黄丹参地龙葛根黄连黄芪蒲公英石斛五味子知母活性成分/个237075142425191119潜在靶点/个157209124121156184236202117169图 1 石斛合剂治疗糖尿病靶点韦恩图注：根据节点度值调整大小及颜色，以度值平均数为区分界限。图 2 石斛合剂治疗糖尿病的靶点基因蛋白互作网络图43福建中医药第 54 卷条目58条，分子功能包括类固醇激素受体活性、相同的蛋白质结合、药物结合等；细胞组分（CC）相关条目 16 条，细胞组成包括细胞外间隙、胞外区、胞外外泌体等部位。按照显著程度进行排名，筛选各排名前 10 的结果，利用微生信网站绘制柱形图，见图3。2.5KEGG 通路分析利用 DAVID 数据库对靶点进行 KEGG 富集分析（P0.05），共得到 80 条通路及其有关信息，选定P值较小的前20条显著通路，利用微生信网站绘制气泡图，结果见图 4。KEGG结果中FoxO信号通路、胰岛素信号通路、PI3K/Akt信号通路等与糖尿病相关性较强，可能作为石斛合剂抗糖尿病的重要通路。2.6成分-靶点-通路网络图的构建利用软件Cytoscape 3.7.2构建石斛合剂“成分-靶点-通路”网络图，该网络图由 291 个节点，3 736 条边构成，见图5。对网络图进行拓扑分析，以度值、介数、紧密度的平均数作为核心成分筛选条件，共筛选得到39个核心成分。核心成分包括表小檗碱（HL8）、新隐丹参酮（DS48）、小檗红碱（HL7）、五味子乙素（WWZ11）、刺芒柄花素（D）、小檗碱（HL4）等。图 3 石斛合剂对于治疗糖尿病的 GO 富集分析图 4 石斛合剂对于治疗糖尿病的 KEGG 富集分析44陈涛 等：基于网络药理学和分子对接探讨石斛合剂治疗糖尿病的作用机制第 1 期2.7分子对接验证选取出PPI网络图中度值排名前 6 的核心靶点（ALB、Akt1、IGF1、EGFR、PPARG、ESR1）与成分-靶点-通路图中核心成分度值排名前 3 的表小檗碱、新隐丹参酮、小檗红碱，利用AutoDock软件进行结合能力预测，将活性成分与靶蛋白对接，发现除小檗红碱与 PPARG 对接结合能-5.0 kcal/mol 外其余结合能均-5.0 kcal/mol，见表2。将最佳对接构象进行PyMol可视化结果展示，以表小檗碱为例，见图6。3讨论本研究结果显示，石斛合剂可能通过 FoxO 信号通路、胰岛素信号通路、PI3K/Akt信号通路等发挥对糖尿病的治疗作用，通过对核心靶点与通路的分析，得出其主要通过调节胰岛素敏感、降低胰岛素抵抗、加速糖脂代谢等方式对糖尿病进行调控，同时还可能对糖尿病的并发症，如糖尿病认知功能障碍、改善糖尿病骨骼肌萎缩等具有治疗作用。通过 PPI 网络分析了石斛合剂成分潜在靶点与糖尿病靶点的交集靶点，得到了石斛合剂抗糖尿病的核心靶点，其中包括 Akt1、IGF1、PPARG 等。其中Akt1是Akt基因的产物，被称为Akt激酶，在人体中具有调节葡萄糖代谢的作用6。在机体缺乏胰岛素时，Akt可通过刺激胰岛素反应型葡萄糖转运蛋白4向质膜转移，从而诱导细胞摄取葡萄糖7。IGF1名为胰岛素样生长因子，在机体中可改善葡萄糖耐量与胰岛素敏感性8。IGF1 还可通过 IGF1/IGF1R 通路作用于甲状腺激素，加速糖脂代谢9。PPARG是一个来自配体激活核激素受体家族的转录因子，它在被激活时调节多种代谢途径，包括脂质生物合成和葡萄糖代谢10。在多项研究中，该靶点的激活与胰岛素增敏和脂质代谢的调节直接相关11-12。在前期对于石斛合剂的研究中，其可以降低糖尿病大鼠血糖、甘油三酯、胆固醇水平，提高胰岛素水平，提高组织摄取葡萄糖的能力，降低肝糖原的释放，并调节 Wnt信号通路减少脂肪积累，促进脂肪分解13-14。注：红色箭头为通路，蓝色矩形为成分，绿色三角形为靶点。图 5 石斛合剂的成分-靶点-通路图表2石斛合剂治疗糖尿病的核心成分 与关键靶点的分子对接结果活性成分表小檗碱新隐丹参酮小檗红碱结合能/（kcal/mol）ALB-5.36-6.83-5.47Akt1-6.75-8.55-5.42IGF1-7.32-5.31-5.17EGFR-5.8