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2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 基于网络药理学及实验验证探究妇科断红饮胶囊治疗功能失调性子宫出血的作用机制何璎1，赵洪庆1，吴梦瑶2，龚云2，王宇红1，张鹏2（1.湖南中医药大学科技创新中心 长沙 410208；2.株洲千金药业股份有限公司 株洲 412000）摘要：目的基于网络药理学及实验验证探讨妇科断红饮胶囊治疗功能失调性子宫出血（DUB）的作用机制。方法借助TCMSP数据库、相关文献检索收集妇科断红饮胶囊潜在活性成分及其药物靶点，通过Gene Cards和VENNY 2.1.0筛选疾病靶点。借助STRING数据库构建基于药物与疾病共同靶点的蛋白质-蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络，利用 DAVID 数据库对共同靶标进行基因本体论（Gene ontology，GO）功能和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，采用Cytoscape 3.6.1构建“活性成分-核心靶点-重要通路”网络。体内复制大鼠DUB模型，妇科断红饮胶囊干预后，检测各组大鼠子宫出血量，RT-qPCR检测血管内皮生长因子（VEGFA）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、白细胞介素（IL6）的水平，Western blot检测蛋白激酶B（AKT）、PI3K、缺氧诱导因子1（HIF-1）的水平，以初步验证网络药理学预测结果。结果网络药理学分析显示，妇科断红饮胶囊可能通过槲皮素、花生四烯酸、木犀草素等活性成分作用于AKT1、VEGFA、IL6等关键靶点。通过HIF-1、PI3K/Akt、核因子B（NF-B）等信号通路，达到止血作用。体内实验验证，妇科断红饮胶囊可改善出血症状，上调PI3K、IL6 mRNA表达和AKT、PI3K、HIF-1蛋白表达，下调VEGFA mRNA表达。结论妇科断红饮胶囊治疗DUB具有“多成分-多靶点-多通路”的作用特点，为后续的实验研究提供了重要数据信息。关键词：妇科断红饮胶囊 功能失调性子宫出血 网络药理学 作用机制 实验验证doi:10.11842/wst.20210923006 中图分类号:R285.5 文献标识码:A功 能 失 调 性 子 宫 出 血（Dysfunctional uterine bleeding，DUB）是指与妊娠、肿瘤、炎症无关的子宫异常出血1。包括月经周期紊乱、子宫出血和月经失血量或持续时间的改变，可导致继发性感染、贫血甚至不孕2-3。其由各种内外因素导致的神经内分泌失调引起4，绝大多数DUB病例中最合理的病理生理机制是 下 丘 脑 垂 体 卵 巢（Hypothalamus pituitary ovary，HPO）轴的不成熟5。DUB的发生还与患者的精神因素密切相关，消极的情绪可导致激素分泌紊乱而引起异常子宫出血6。它可以发生在排卵和无排卵周期，月经初潮和更年期之间7。DUB可通用药物或手术治疗，临床上还可采用系统护理，通过缓解DUB患者不良情绪加快康复进程7。药物治疗多选取避孕药、孕酮、雌激素等，手术治疗包括宫腔镜手术和子宫切除术8。其局限性为副作用大、安全性低，对患者的生殖能力造成影响9。因此开发针对DUB的有效药物刻不容缓。DUB多属中医的“崩漏”、“月经量多”等病证，病机错综复杂，病本在肾10，中医药治疗DUB有其独特优势，并且疗效已经得到证实11-12。妇科断红饮胶囊由赤芍、益母草、三七、仙鹤草、地榆炭、蒲黄炭等药组 收稿日期：2021-09-23 修回日期：2022-05-03 国家自然科学基金委员会面上项目（81874464）：基于KYN和FKN双信号通路研究胶质细胞激抑失衡致糖尿病并发抑郁症海马“Quad-Partite”突触可塑性损伤机制及中药干预，负责人：王宇红；湖南中医药大学产学研合作项目（2020430102003701）：妇科断红饮胶囊止血机制研究，负责人：王宇红。通讯作者：张鹏，高级工程师，主要研究方向：中药创新药物研究；吴梦瑶，硕士，主要研究方向：中药药理研究。4444 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与妇科疾病研究成，具有凉血、止血、化瘀之效。临床研究表明妇科断红饮胶囊治疗DUB时，止血作用相对较强且作用较为迅速，对改善患者头晕、烦躁等症状具有改善作用，临床试验过程中没有发现明显不良反应，药物临床应用较为安全，该产品临床证明治疗DUB安全有效13，然而，妇科断红饮胶囊治疗DUB的作用机制尚不明确。网络药理学可以揭示药物、成分、靶点和疾病之间复杂的整体生物网络关系，能够揭示中药复方和疾病之间的关联性，为分析和预测药物的药理机制提供了新的视角14-15。因此，本研究采用网络药理学预测妇科断红饮胶囊治疗DUB的作用机制并结合体内实验进行验证，进一步为妇科断红饮胶囊的临床应用提供理论依据。1 研究思路与方法 本文应用网络药理学方法构建妇科断红饮胶囊“活性成分-核心靶点-重要通路”网络，预测妇科断红饮胶囊的止血作用机制的活性成分，可能的核心靶标和重要通路。构建DUB大鼠模型，采用RT-qPCR和Western blot 方法预测网络药理学预测结果，流程图见图1。2 研究和分析 2.1妇科断红饮胶囊化学成分和靶点的收集和筛选通过中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP，https:/ proteins搜索功能以及UniProt（http:/www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能将所得到的蛋白校检为官方名称，剔除非目标活性成分，获得相关靶点的信息。2.2疾病靶点的获取与收集在 Gene Cards（https:/www.genecards.org/）中以关键词“haemorrhage”进行查询，将所得结果导入 Excel表格，与妇科断红饮胶囊的候选靶标蛋白共同导入VENNY 2.1.0（https:/b.csic.es/tools/venny/）进行匹配映射生成韦恩图。查找共同靶点所对应的化学成分，将其导入 Cytoscape 3.6.1（https:/cytoscape.org/）得到各项拓扑参数，筛选大于平均度值的节点，得到妇科断红饮胶囊止血作用的主要化学成分。2.3PPI的构建及其核心网络的筛选为进一步了解妇科断红饮胶囊的潜在靶点对止血功能的具体作用机制，再将共同基因导入STRING数据库，物种限制为“Homo sapiens”，置信度设为中等0.04，获取蛋白质相互作用关系，得到PPI核心网络，并 将 结 果 以 TSV 格 式 导 入 Cytoscape 3.6.1（https:/cytoscape.org/），对节点度（degree）值进行分析，确定妇科断红饮胶囊止血的核心靶点。2.4GO和KEGG分析以了解筛选出的核心基因功能及其在信号通路中的作用为目的，将筛选所得的共同靶点导入生物学信息注释数据库（DAVID，https:/david.ncifcrf.gov/），限图1基于网络药理学及实验验证探究妇科断红饮胶囊治疗DUB的作用机制研究流程图4445 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 制物种条件为“Homo sapiens”，设定阈值为P0.05，采取GO生物学过程富集分析和KEGG信号通路富集分析，再用在线绘图网站imageGP（http:/ GraphPad Prism 7 将 结 果 可 视 化处理。2.5妇科断红饮胶囊“活性成分-核心靶点-重要通路”网络的构建将妇科断红饮胶囊的活性成分、与疾病的共同作用靶点、基因名等信息在 Excel 表格中建立“活性成分-核心靶点”、“核心靶点-重要通路”相互对应关系，导入Cytoscape 3.6.1软件，构建“活性成分-核心靶点-重要通路”网络。该网络中节点表示活性成分，靶点及作用通路，边表示各节点间的相互作用关系。2.6妇科断红饮胶囊止血作用体内实验验证2.6.1实验动物SD大鼠，雌性30只，体质量250-300 g；雄性15只，体质量350-400 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（）湘）2019-0004，饲养于湖南中医药大学动物实验中心。2.6.2药物妇科断红饮胶囊由株洲千金药业股份有限公司生产，批号：20200401，规格：0.4 g18粒。2.6.3主要试剂和仪器试剂：羟基脲（H37021289，齐鲁制药有限公司）；醋酸氢化可的松片（H31021270，上海上药信谊药厂有限公司）；米非司酮片（H10950347）、米索前列醇片（H20084598）均购自浙江仙琚制药股份有限公司；AKT抗体（BS-0115R）、PI3K抗体（BS-10657R）均购自北京博奥森生物技术有限公司；HIF-1抗体（PAB44110，武汉华联科生物技术有限公司）。仪器：梯度 PCR 仪（杭州晶格科学仪器有限公司）；超微量核酸蛋白浓度测定仪（英国 BioDrop 公司）；T10BS25型全自动匀浆仪（德国IKA公司）；ECO型 PCR扩增仪（美国 illumina公司）；Chemi Doc XRS+Imager型化学发光系统（美国Bio-Rad公司)。2.6.4造模、分组及给药参考文献24，将SD大鼠以雌：雄2 1的比例合笼，次日检测雌性大鼠阴道栓并进行阴道涂片，确定大鼠是否受孕。将成功受孕的大鼠随机分为空白组、模型组及妇科断红饮胶囊组，每组6只。从妊娠第1天起，除空白组外，各组于8 00灌胃羟基脲450 mgkg-1，皮下注射氢化可的松 3.7 mgkg-1，持续 7 天。妊娠第8天，分别于 8 00和 18 00灌胃米非司酮 8.5 mgkg-1和米索前列醇0.1 mgkg-1，以复制DUB模型。模型制备成功后，妇科断红饮胶囊组给予前期证实有效的临床等效4倍剂量（1.296 gkg-1），体积为10 mLkg-1，空白组和模型组分别给予等剂量的生理盐水，干预14天。给药完成后，麻醉大鼠，分离子宫组织于液氮中保存备用。2.6.5子宫出血量测定剪 尾 法 收 集 大 鼠 血 液 20 L，加 入 4 mL 5%NaOH，混匀。并将收集的含有每只大鼠的子宫血液棉球置于 EP 内，根据出血量的实际情况加适量 5%NaOH，一般为 4-7 mL，浸渍提取一段时间后浸泡挤压搓洗棉球血渍至洗脱液无色为止，以 5%NaOH 溶液为空白对照，在 546 nm 处分别测定浸提液以及大鼠静脉血的吸光度（A）。阴道出血量（L）=静脉血量（A 子宫浸提液V2）/（A 静脉血V1），式中，V1，V2分别为稀释静脉血及浸提子宫血所用NaOH的量（mL）。2.6.6RT-qPCR检测VEGFA、PI3K、IL6mRNA水平每组取大鼠子宫组织置于玻璃匀浆器中，按照TRIzol RNA 提取试剂盒说明提取总 RNA，测定 RNA浓度和纯度后按照 Thermo 试剂盒说明进行逆转录，RNA 逆转录得到 cDNA 后使用 PCR 扩增仪进行 PCR扩增。测定各组织样本PCR产物Cq值，基因的mRNA相对表达量采用2Ct法计算，各基因引物序列信息见表1。2.6.7Western blot检测AKT、PI3K、HIF-1蛋白水平每组取大鼠子宫组织全蛋白，BCA法定量蛋白浓度，随后对蛋白依次进行变性；电泳（120 V，60 min）；转膜（200 mA，120 min）；脱脂牛奶中封