基于网络药理学和分子对接探...茶治疗2型糖尿病的作用机制_梁林盼.pdf

第 41 卷 第 1 期2023 年 1 月 广西师范大学学报(自然科学版)Journal of Guangxi Normal University(Natural Science Edition)Vol.41 No.1Jan.2023DOI:10.16088/j.issn.1001-6600.2021112401http:梁林盼,凌雪,方姣,等.基于网络药理学和分子对接探讨瑶山甜茶治疗 2 型糖尿病的作用机制J.广西师范大学学报(自然科学版),2023,41(1):143-154.LIANG L P,LING X,FANG J,et al.Mechanism of Rubus suavissmus S.Lee in intervention of type 2 diabetes mellitusbased on network pharmacology and molecular docking methodJ.Journal of Guangxi Normal University(Natural Science Edition),2023,41(1):143-154.?基于网络药理学和分子对接探讨瑶山甜茶治疗 2 型糖尿病的作用机制梁林盼1,2,凌 雪3,方 姣1,苏志恒3,郑 华1(1.广西医科大学 生命科学研究院,广西 南宁 530021;2.柳州市人民医院,广西 柳州 545006;3.广西医科大学 药学院,广西 南宁 530021)摘 要:为了探讨瑶山甜茶治疗 2 型糖尿病的作用机制,应用高脂高糖饲料喂养结合链脲佐菌素(STZ)复制 2 型糖尿病大鼠模型,观察大鼠血糖和胰腺组织的变化;运用系统药理学方法查找并筛选瑶山甜茶的活性成分靶点及 2 型糖尿病相关基因,并进行富集分析以预测其可能的信号通路,对筛选所得核心成分与核心靶点进行分子对接验证,探究其分子机制。结果表明:瑶山甜茶显著降低糖尿病模型大鼠血糖(P11.1 mmol 的大鼠纳为实验对象。将造模成功的大鼠分为模型组(M)、二甲双胍阳性药组(P)和瑶山甜茶给药组(T),每组 n=6。正常组和模型组给予相等体积的蒸馏水灌胃,阳性药组给予 200 mg/kg 的二甲双胍,给药组给予 3 g/kg 的瑶山甜茶8。实验结束后,将大鼠处死,取出胰腺,用生理盐水冲洗,浸入 10%福尔马林缓冲溶液中固定 24 h,然后包埋在石蜡中,切成 5 m 的厚度。HE 染色,中性树胶封固,用光学显微镜观察组织形态。2.3 统计学分析采用 SPSS26.0 软件进行统计分析,结果表示为平均值加减标准差(?xSE),组间差异用 t 检验分析。P0.05 为差异有统计学意义。441http:2.4 瑶山甜茶活性成分的检索与筛选瑶山甜茶为地方性民族药,未收录在各数据库中,因此本研究通过不同关键词的检索,在与其有关的大量文献中,收集瑶山甜茶的化学成分信息,并剔除重复和结构不明确的成分进行汇总。2.5 瑶山甜茶活性成分和 T2DM 靶点的预测与筛选通过 PubChem 数据库(https:pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和 ChemDraw 软件查找筛选得到每个成分的 SMILES 号并保存。把 SMILES 号输入 Swiss Target Prediction 数据库(http:www.swisstargetprediction.ch)、STITCH 数据库(http:stitch.embl.de/)和 SEA 数据库(http:sea.bkslab.org/)预测成分靶点。再把预测得到的靶点输入 UniProt 数据库(https:www.uniprot.org),将蛋白质名称转换为正式的基因名称。在 GeneCards 数据库(https:www.genecards.org/)对 T2DM 相关靶点进行检索,以 T2DM 的英文名“type2 diabetes”为关键词,获得 T2DM 相关疾病的靶点。2.6 瑶山甜茶活性成分-靶点-T2DM 网络的构建将瑶山甜茶活性成分靶点和 T2DM 的疾病靶点上传到韦恩图在线作图工具Venny 2.1(https:b.csic.es/tools/venny/index.html)获取两者交集靶点;之后,将交集的靶点与其对应成分导入到Cytoscape 3.7.1 软件中构建可视化网络。2.7 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络的构建将交集靶点上传到 STRING 数据库(https:stringdb.org/),限定物种为 Homo sapiens,选择置信度大于0.9,隐藏网络中游离的靶点,结果以 TSV 形式导出。之后,将 TSV 文件导入 Cytoscape 3.7.1 软件得到可视化 PPI 网络,分析靶点的拓扑性质,得到瑶山甜茶干预 T2DM 的核心靶点。2.8 富集分析将核心靶点导入 DAVID 数据库(https:david.ncifcrf.gov/),分析 GO 和 KEGG 通路,以 P 小于 0.05为条件进行筛选,最后将富集结果进行图表可视化。2.9 分子对接验证首先从 PDB 数据库(https:www.rcsb.org/)下载核心靶点蛋白结构,以 PDB 格式保存,并导入 Sybyl-X 2.0 软件,去除水分子和侧链残基,加氢并且修复侧链,提取蛋白靶点结构配体;之后使用 Openbabel 将瑶山甜茶的核心成分转化为.mol2 格式,并导入 Sybyl-X 2.0 软件,采用分子力学程序 Minimize 进行结构优化:Powell 能量梯度法、最大重复次数 1 000、Gradient 0.005、Tripos 力场、Gasteiger-Huckel 电荷。利用Sybyl-X 2.0 软件获得 3 个核心成分与 6 个核心靶点对接得分值,得分值大于 4.25,说明瑶山甜茶的核心成分与核心靶点有一定的结合能力,大于 5.0 说明结合能力较好。3 实验结果与分析表 1 瑶山甜茶对 T2DM 大鼠空腹血糖的影响Tab.1 Effect of Rubus suavissmus S.Lee onfasting blood glucose in T2DM rats组别6 周血糖浓度/(mmolL-1)正常组6.40.366 1模型组24.6671.665 9 二甲双胍阳性药组17.4332.256 3#瑶山甜茶给药组18.2331.549 8#注:与正常组比较,表示 P0.01;与模型组比较,#表示P0.05。3.1 瑶山甜茶对 T2DM 模型大鼠血糖的影响如表 1,瑶山甜茶给药组可以显著降低 T2DM 大鼠的 FBG(P0.05)。3.2 瑶山甜茶对 T2DM 模型大鼠胰腺组织的影响如图 1,正常组大鼠胰腺组织形态规则,边界清晰,类圆形,由几十个内分泌细胞组成,细胞为圆形,排列整齐,分布均匀,细胞间有丰富的毛细血管,边界清晰;模型组胰腺组织表现出边界模糊,分泌细胞数目减少,细胞排列紊乱,呈小团聚状,细胞大小不等,结构萎缩,胞浆肿胀,可见有空泡变性,细胞核大小不等。瑶山甜茶给药组大鼠胰腺分泌细胞形态结构有所改善,分泌细胞数目增多,细胞排列较规则和整齐,胞浆分布均541广西师范大学学报(自然科学版),2023,41(1)匀,肿胀细胞和空泡变性极少,与模型组比较有明显好转;二甲双胍阳性药组与模型组比较胰腺细胞团形态结构有改善,胰腺萎缩程度减轻,病理改变均减轻。A.正常组;B.模型组;C.二甲双胍阳性药组;D.瑶山甜茶给药组图 1 各组大鼠胰腺组织 HE 切片图(200)Fig.1 HE sections of each group of rats with pancreatic tissue(200)3.3 瑶山甜茶中的化学成分结合文献检索及删除结构不明的成分,最终共筛选出 59 个成分,见表 2。表 2 瑶山甜茶中的活性成分Tab.2 Active components of Rubus suavissmus S.Lee编号化合物分子式相对分子质量1斯替维醇C20H30O3318.452槲皮素C15H10O7302.243-谷甾醇C29H50O414.7142,3,23-三羟基-乌苏-12-烯-28-酸C30H48O5488.705胡萝卜苷C35H60O6576.8562,3,19,23-四羟基-乌苏-12-烯-28-酸C30H48O6504.7072,3,19,23-四羟基-齐墩果-12-烯-28-酸C30H48O6504.708山奈酚-3-O-D-6-O-(对羟基桂皮酰基)-吡喃葡萄糖苷C30H24O13592.5092,3,19,23,24-五羟基-乌苏-12-烯-28-酸C31H49O7533.7210槲皮素-3-O-D-核糖苷C20H16O11432.3311槲皮素-3-O-D-吡喃葡萄糖苷C21H20O12464.38122,3-O-(缩丙酮)-2,3,19,23-四羟基-乌苏-12-烯-28-酸C34H53O6557.78132,3-O-(缩丙酮)-2,3,19,23,24-五羟基-乌苏-12-烯-28-酸C34H53O7573.78142,3-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸C30H48O4472.7015甜叶悬钩子苷 RubusosideC32H50O13642.73163,16,17-三羟基贝壳杉烷C21H36O3336.5117(2R,3S)-dihydrodehydroconiferyl alcoholC20H24O6360.40187-羟基斯替维醇C21H32O4348.48641http:续表2编号化合物分子式相对分子质量197,8-dihydro-buddlenol B(赤式)(erythro)C31H40O10572.64207,8-dihydro-buddlenol B(苏式)(threo)C31H40O10572.642116,17,19-三羟基贝壳杉烷C21H36O3336.5122对映-16,17-二羟基-贝壳杉-19-酸C21H34O4350.49233,16,17,19-四轻基贝壳杉烷C21H36O4352.5124舒格洛克苷C26H42O8482.6125甜茶苷 AC26H44O8484.6226panicloside IVC26H42O9498.6127山奈酚C15H10O6286.2428正三十一烷C31H64436.8429正三十二烷醇C32H66O466.8730正三十二烷酸C32H64O2480.8531软脂酸C16H32O2256.4232齐墩果酸C30H48O3456.7033熊果酸C30H48O3456.7034camelliatannin AC49H36O271 056.7935斯特维单糖甙C26H40O8480.5936槲皮素-3-D-半乳糖甙C21H20O12464.3837没食子酸C7H6O5170.1238糅花酸C14H6O8302.19392-吡喃酮-4,6-二羧酸C7H4O6184.1040云实酸C13H8O8292.2041地榆皂酸二内酯C21H10O13470.3042咖啡酸C9H8O4180.1643对映-贝壳杉-3,16,17-三醇C21H32O3332.4844对映-13,17-二羟基-贝壳杉-15-烯-19-羧酸C27H42O8494.6245叶酸C19H19N7O6441.4046尼克酸C6H5NO2123.1147表儿茶素C15H14O6290.2748表儿茶素没食子酸酯C22H18O10442.3849表没食子儿茶素C15H14O7306.2750表没食子儿茶素没食子酸酯C22H18O11458.4051苹果酸C4H6O5134.0952枸橼酸C76H52O461 701.2053奎尼酸C7H12O6192.1754杨梅素C15H10O8318.2455黄芪苷C21H20O11448.3856芦丁C27H30O16610.51857甜茶苷C32H50O13642.7358甜菊酯单苷C26H40O8480.