基于丝素蛋白的可注射水凝胶在肌肉再生工程的应用_李艾元.pdf

研究与技术丝绸JOUNAL OF SILK基于丝素蛋白的可注射水凝胶在肌肉再生工程的应用Application of injectable hydrogel based on silk fibroin in muscle regeneration engineering李艾元，施心雨，刘梦斐，李诚，宣智宏，岳万福(浙江农林大学 动物科技学院动物医学院，杭州 311300)摘要:针对丝素蛋白水凝胶可注射性较差、机械性能不稳定、无法植入细胞等问题，文章制作了一种新型的可注射丝素蛋白水凝胶。通过弱碱法脱去蚕丝的丝胶蛋白，经过溶解、透析、离心、过滤后获得丝素蛋白溶液，利用磷脂诱导丝素蛋白溶液形成水凝胶。将水凝胶和细胞通过注射的方式植入湖羊耳部，分别在 1、6、11 d 取出水凝胶肌肉细胞生长样品，通过 Masson 染色研究了水凝胶的降解规律和肌肉再生的过程。结果表明:这种基于丝素蛋白的新型水凝胶凝胶时间可控，制备简单，具有可注射性。水凝胶可以植入细胞，并且细胞在水凝胶中形成新的肌肉组织，说明这种基于丝素蛋白的新型水凝胶可以用作肌肉再生工程。进一步梳理丝素蛋白水凝胶的制备过程和切片结果发现:水凝胶制作简单，细胞在水凝胶中可以增殖分化，只需要注射就可以进入动物体内，在动物体内还可以降解。最终结果表明:基于丝素蛋白的水凝胶可以用肌肉组织再生工程，磷脂诱导的方式使水凝胶具备可注射性。关键词:水凝胶;自凝结;磷脂;丝素蛋白;折叠中图分类号:TS1014文献标志码:A文章编号:10017003(2023)02004207引用页码:021105DOI:10 3969/j issn1001-7003202302005收稿日期:20220223;修回日期:20221209基金项目:浙江省基础公益研究计划项目(LQY19F010002);浙江省农业重大科技专项项目(2021C02068-6)作者简介:李艾元(1995)，男，硕士研究生，研究方向为丝素蛋白水凝胶的开发。通信作者:岳万福，副教授，20110058 zafu edu cn。蚕丝作为一种多用途的高分子聚合物，在组织工程和再生医学中的应用得到了广泛的探索1。丝素蛋白是从蚕丝提取的纤维蛋白2。丝素蛋白由一条重(H)链和一条轻(L)链组成，通过二硫键相连，形成 HL 复合物3。这种 HL 复合物还通过疏水作用以 61 的比例结合形成一种糖蛋白(P25)，三者构成基本胶束单元4。除了丝素蛋白外，蚕丝中还存在丝胶蛋白5，当蚕结茧时，丝胶蛋白起到胶水的作用，丝胶蛋白将丝 素 蛋 白 结 合 在 一 起，丝 胶 蛋 白 占 蚕 丝 的 重 量 近30%6。丝素蛋白是一种生物相容性材料，因为它不会引起长期或持久的炎症反应7。当植入人体内时，它会引起轻微的初始炎症反应，并随时间消退，表明丝素蛋白具有免疫相容性，与其他常见生物材料相比，丝素蛋白的免疫原性较低8。湖羊肌肉卫星细胞具备分化成湖羊肌肉组织的能力，与本次实验对象湖羊来自同源，不会引起免疫排斥反应。肌肉损伤和老化是人体肌肉主要的疾病形式9。肌肉损伤的修复过程首先需要激活肌肉卫星细胞，因为新肌肉纤维或原发性肌纤维的形成始于肌肉卫星细胞的激活10。其次是肌肉卫星细胞的增殖和分化阶段，形成肌细胞。最后通过肌细胞融合形成肌纤维，并整合到现有的肌肉中，完成肌肉的自我修复11。尽管肌肉具有与生俱来的再生能力，但某些条件下自我修复最终达不到健康的肌肉组织的标准，反而导致萎缩、发病和功能丧失12。例如，严重的车祸和大面积烧伤等意外中，肌肉组织的大量损失会阻碍修复过程并妨碍肌肉的功能恢复13。此外，某些肌肉萎缩疾病也可以阻止正常的肌肉组织再生过程14。肌肉卫星细胞疗法是增强肌肉修复的一种新的手段，采用自体或同种异体干细胞来增强自身肌肉修复的能力15。组织工程技术尚未生产出用于治疗肌肉损伤的可靠产品，市面上人工合成物质在人体内难以降解并会引发免疫排斥反应，因此丝素蛋白水凝胶逐渐进入人们的视野16，丝素蛋白水凝胶能够为细胞提供附着点和与细胞发生特异性作用，可调节的物理支撑，连接水凝胶内外的孔隙结构，进行氧气、营养物质和生长因子的交换17，因此非常适合作为肌肉组织再生的细胞支架18-19。利用水凝胶进行肌肉组织工程已成为一种有希望的治疗方案。例如，将丝素蛋白水凝胶用作封装肌肉细胞的递送载体，发现丝素蛋白水凝胶能够促进肌肉细胞的增殖和分化，丝素蛋白水凝胶能够促进肌肉细胞整合，同时保护移植细胞免受移植手术加剧的慢性炎症环境的24第 60 卷第 2 期基于丝素蛋白的可注射水凝胶在肌肉再生工程的应用影响20。鉴于丝素蛋白水凝胶的多功能性，丝素蛋白水凝胶构成了独特的生物材料，广泛用于组织工程研究及许多肌肉疾病和损伤病理学21。图 1 为 DMPG 诱导的丝素蛋白水凝胶制作工艺。首先将丝素蛋白溶解，得到丝素蛋白溶液，再将 DMPG 溶液加入到丝素蛋白溶液中，混合均匀后将细胞悬液加入到混合溶液中，然后用注射器将处于溶胶状态的丝素蛋白水凝胶注射到动物体内22。期望通过这种方式获得一种生物相容性良好的丝素蛋白水凝胶，能够为人类再生医学植入治疗肌肉损伤奠定基础。图 1丝素蛋白水凝胶制作工艺示意Fig1Schematic diagram of silk fibroin hydrogel making process1实验1 1试剂PBS 缓冲液(杭州浩克生物技术有限公司)，碳酸氢钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶-EDTA 消化液、胶原酶、CCK-8试剂盒、DAPI 溶液、4%多聚甲醛、曲拉通 Triton X-100(北京索莱宝科技有限公司)，溴化锂(国药集团化学试剂有限公司)，透析袋(上海索桥生物科技有限公司)，F12 培养基(杭州昊鑫生物科技有限公司)，MYHC 一抗、DESMIN 一体、FITC标记的二抗(武汉爱博泰克生物科技有限公司)，活细胞/死细胞双染试剂盒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)，100 m细胞筛网(康宁(上海)有限公司)。1 2仪器烘箱(上海跃进医疗器械有限公司)，载玻片及盖玻片(江苏汇达医疗器械有限公司)，SI-A256 涡旋仪(秒生科技有限公司)，MC2 掌上离心机(上海吉泰生物科技有限公司)，ECLIPSE E100 显微镜、ECLIPSE C1 荧光显微镜(NIKON)，KE003068 移液枪(Dragon 公司)，SU8010 台式扫描电子显微镜(日本松下公司)，冻干机(香港力康发展有限公司)，磁力搅拌器、iS50 FTI 傅里叶红外测谱仪、纯水仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，KS-600D 超声波水域锅(宁波海曙超声科技设备有限公司)。1 3丝素蛋白的制备参照文献 23 的脱胶方法，利用丝素蛋白与丝胶蛋白溶解度不同来获得丝素蛋白，首先将蚕丝用剪刀剪为 2 4 cm长度，按 1200 的浴比放入 0 5%的碳酸氢钠溶液中煮沸30 min，期间每隔 15 min 用玻璃棒翻一次，煮好后用去离子水洗脱 3 次，此时丝胶蛋白溶解在 0 5%碳酸氢钠溶液中;蚕丝煮好后用去离子水清洗 6 次，最后将脱胶的蚕丝放入烘箱，温度设置为 37，干燥 12 h 后放入通风干燥处保存，即可得到丝素蛋白。1 4丝素蛋白溶液的制备参照文献 23 的溶解方法，首先配置摩尔浓度为93 mol/L的溴化锂溶液。即 1 L 的烧杯中称取 807 7 g 无水溴化锂，加入 600 mL 超纯水溶解，使用磁力搅拌器使溴化锂完全溶解，冷却后加水到 1 000 mL，使用循环水真空泵过滤溶液至澄清，得到澄清的 9 3 mol/L 的溴化锂溶液。将脱胶干燥后的丝素蛋白撕扯成蓬松的棉花状，事先将溴化锂溶液放入 60 的烘箱中预热 30 min，之后将丝素蛋白与溴化锂溶液按照 14 的溶质比溶解，丝素蛋白完全没入溴化锂溶液后再放入 60 恒温烘箱中继续溶解 2 h，期间每隔 15 min 拿出来搅拌一次，溶解完毕后得到黄色的丝素蛋白溴化锂混合溶液。将混合溶液放入透析袋中透析 3 d，纱布过滤之后低温高速离心机7 000 r/min 离心 20 min，上清液用 0 22 m 针头滤器过滤后放入 4 备用。1 5湖羊肌肉卫星细胞的获取湖羊肌肉卫星细胞的分离采用胶原酶消化法:1)无菌条件下，剥离湖羊胎儿后肢腿部肌肉组织，用 75%乙醇轻微浸泡消毒后立即用 PBS 冲洗2 次，放入盛有 PBS 的35 mm 细胞培养皿中;2)利用眼科剪将肌肉组织剪碎，加入适量型胶原酶后放入 37、5%CO2培养箱中消化 15 min，每隔5 min 取出吹打一次，共 3 次;3)消化结束后，加入 2 倍体积 A 培养基(F12 培养基+10%胎牛血清)终止消化，用 100 目细胞筛过滤并收集细胞悬液至 15 mL 离心管中，低速离心机室温1 200 r/min 离心 15 min，弃上清液;4)加入 B 培养基(F12 培养基+10%胎牛血清+1%双抗)重悬细胞，将细胞悬液接种至 100 mm 细胞培养皿中，普通光学显微镜下观察细胞形态，放入 37、5%CO2培养箱中进行培养。正常传代培养冻存，生长至对数生长期，后续用于注射湖羊体内。1 6湖羊肌肉卫星细胞的传代与冻存将湖羊肌肉卫星细胞传至 P2P5 代，显微镜下观察细胞34Vol 60No2Application of injectable hydrogel based on silk fibroin in muscle regeneration engineering形态。使用血细胞计数板计数，在细胞密度至少达到 1 106mL 时，进行传代培养，按照 13 的比例进行传代培养。湖羊肌肉卫星细胞的冻存液采用“现配现用”的原则，将胎牛血清与二甲基亚砜(DMSO)按照 10 1 的比例进行配比，在细胞密度达到 1 106mL 进行冻存。具体步骤为:在无菌条件下，首先用 PBS 洗去培养基，加入 1 mL 的胰酶进行消化，消化结束后，加入 2 倍体积 A 培养基(F12 培养基+10%胎牛血清)终止消化，低速离心机室温 1 200 r/min 离心 5 min，弃上清液，加入 1 mL 冻存液重新悬浮细胞，放入 2 mL 冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，80 保存 24 h 后放入液氮长期保存。1 7湖羊肌肉卫星细胞的鉴定1)将生长至对数生长期的湖羊肌肉卫星细胞在 24 孔细胞培养皿中培养至 70%80%密度;2)移除培养基，用预冷的 PBS 缓冲液洗 5 次，每孔加入200 L 的 4%多聚甲醛，将细胞培养皿放入冰上，固定15 min;3)移液枪移除多聚甲醛，用PBS 洗5 次，每孔加入200 L0 25%Triton X-100 对细胞进行透化 10 min;4)移除0 25%Triton X-100，之后用 PBS 洗5 次，每孔加入 200 L 封闭液(含0 25%Triton X-100 的 PBS)，放入4 过夜;5)移除封闭液，用 PBS 洗 5 次，按照 1100 的比例稀释一抗，每孔加入 100 L 一抗稀释液，4 孵育 24 h;6)移除一抗，用 PBS 洗 5 次，按 150 的比例稀释二抗，每孔加 100 L 二抗稀释液，室温避光孵育 1 h;7)移除二抗稀释液，用 PBS 洗 5 次，每孔加入 100 LDAPI 染液，避光孵育 15 min，PBS 洗 5 次，彻底洗去 DAPI 染液，使用荧光显微镜观察。1 8丝素蛋白水凝胶的制备制备的方法采用物理混合的方法，将丝素蛋白溶液(质量分数为 3%)，分别与三种摩尔浓度 DMPG 溶液混和。具体过程为:首先将 DMPG 与去离子水水和，然后超声波水浴加热30 min，将丝素蛋白溶液烘干称重(一般为 6%)，两者混合后保持 DMPG 的终摩尔浓度依次为 5、10、15 mmol/L，丝素蛋白终质量分数为 3%，制得三种摩尔浓度的胶块，放入 4 以便后续测定使用。1 9水凝胶结构测试取适量冻干后的水凝胶样品于研钵中，加入溴化钾研磨均匀，压片