基于体外发酵模型的连朴饮及...对对人体肠道菌群影响的研究_汪琪琪.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：湖北省教育厅科研计划项目（）；湖北省科技厅青年项目（）作者简介：汪琪琪（），女（汉族），湖北钟祥人，湖北中医药大学在读硕士研究生，主要从事中药多糖与肠道菌群相关研究工作通讯作者简介：殷明珠（），女（汉族），湖北洪湖人，湖北中医药大学基础医学院实验师，博士学位，主要从事肠道菌株代谢中药多糖机制的研究工作通讯作者简介：吕 露（），女（汉族），湖北黄陂人，湖北中医药大学基础医学院高级实验师，学士学位，主要从事中医药防治感染性疾病相关研究工作基于体外发酵模型的连朴饮及黄连 厚朴药对对人体肠道菌群影响的研究汪琪琪，毛宁峰，张志刚，吕 露，殷明珠（湖北中医药大学，湖北 武汉）摘要：目的 采用模拟人体肠道进行体外发酵的方式，研究连朴饮及黄连 厚朴药对对人体肠道菌群的影响。方法 建立体外厌氧发酵模型，将连朴饮及黄连 厚朴药对分别与人体肠道菌群进行体外发酵，并以不加药培养基作为对照。测定发酵过程中发酵液、变化，并通过 高通量测序研究肠道菌群变化。结果 与对照组相比，黄连 厚朴药对组 低于对照组，发酵液 高于对照组。而连朴饮组发酵液 及 变化不明显。发酵后黄连 厚朴药对降低了拟杆菌属、双歧杆菌属等菌群的丰度，连朴饮组菌群的种类及丰富度变化不明显。结论 连朴饮对人体肠道菌群具有一定的调节作用，而黄连 厚朴药对具有抑菌作用，降低了菌群的丰度及多样性。关键词：连朴饮；黄连 厚朴药对；肠道菌群；体外发酵 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）连朴饮源于清代医家王孟英撰写的霍乱论卷下，又名王氏连朴饮，现代医家多将其用于治疗胃肠功能紊乱，急、慢性肠胃炎，功能性消化不良等证属脾胃湿热者。连朴饮功效清热化湿、理气和中，该方由黄连、芦根、法半夏、豆豉、石菖蒲、制厚朴、焦栀子 味药物组成。黄连 厚朴药对源自太平圣惠方“厚朴丸”，是临床常用药对之一。因黄连味苦性寒，具有清热解毒、燥湿泻火之效；厚朴味苦性温，具有行气降逆、燥湿除满之功，；二药相互为伍，一寒一热，辛开苦降，可共调中焦脏腑寒热虚实、平调气机升降，常被广泛运用于中焦脾胃病证的治疗，。肠道菌群是一个复杂的微生物群落，以共生的方式存在于人体肠道中，在人体的生长发育、免疫调节、抗肿瘤活性等生理功能中发挥着重要作用。人类肠道菌群主要包括拟杆菌门（）、厚壁菌门（）、放线菌门（）、变形菌门（），其中厚壁菌门和拟杆菌门占肠道菌群的。在正常人体内以乳酸菌、双歧杆菌、拟杆菌等益生菌为主，它们共同参与人体内营养物质代谢，调节人体肠道的结构和功能，从而维持人体健康。近年来，有研究发现中药复方能够调节人体肠道菌群，保护肠粘膜屏障。大多数中药主要通过口服进入人体，已有研究表明许多中药成分能够调节肠道菌群的种类及多样性，从而发挥治疗疾病的作用。本研究通过构建体外发酵模型，将连朴饮及黄连 厚朴药对分别与肠道菌群进行体外厌氧发酵，并通过 高通量测序分析发酵过程中肠道菌群的结构及多样性的变化，探讨连朴饮及黄连 厚朴药对对肠道菌群的调节作用，以期为连朴饮在临床上的开发和应用提供新的方法和思路。材料、仪器与方法 实实验验材材料料 黄连、厚朴、法夏、炒栀子、蒲公英、石菖蒲、芦根及淡豆豉均购自天济大药房连锁有限公司，培养基、氯化血红素、维生素 均购自青岛海博生物技术有限公司。实实验验仪仪器器 恒温培养箱（上海博迅实业有限公司），计（上海仪电科学仪器有限公司），多功能酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），厌氧发酵罐（美国 ），发酵后的菌液送至北京奥维森基因科技有限公司检测肠道菌群相关指标。实实验验方方法法 中中药药药药液液制制备备 中药水煎液由黄连（），厚朴（），法夏（），炒栀子（），蒲公英（），石菖蒲（），芦根（），淡豆豉（）于 蒸馏水中浸泡 后煎煮，重复煎煮 次，最终收集两次煎煮药液并浓缩至 ，用 滤器过滤除菌后存放于 冰箱备用。黄连 厚朴药对由黄连（）及厚朴（）按照同样方式煎煮浓缩至 后，过滤灭菌备用。人人粪粪便便悬悬液液制制备备 取五名志愿者粪便（男女 ），要求志愿者身体健康且 个月内未服用抗生素。每名志愿者称取 粪便于 离心管中，每管加入 无菌厌氧，震荡混匀，离心 后，取上清于无菌玻璃瓶中。向沉淀中再次加入 无菌厌氧，震荡混匀，离心 后，取上清于无菌玻璃瓶中，并将两次上清充分混匀后即得到 人粪便悬液。模模拟拟体体外外发发酵酵 将 新鲜 粪便悬液加入到 含 连朴饮的 培养基或 黄连 厚朴药对的 培养基中，以空白 培养基作为对照，混匀后分装至无菌玻璃试管中，每支试管 。最终将试管放置于厌氧罐中，厌氧培养。分别于、取样进行进一步分析，每种处理分析 个独立的样品。发发酵酵液液组组成成变变化化测测定定 使用多功能酶标仪测定不同时间点发酵菌液在 处的吸光度，使用 计测定不同时间点发酵液的 值。肠肠道道菌菌群群检检测测 收集发酵 的菌液，使用细菌基因组 提取试剂盒提取不同组别的肠道菌群基因组，对细菌的 的 区进行 扩增，采用高通量测序平台 对 产物进行测序。根据结果统计群落在各个水平（门、纲、目、科、属、种）的含量变化，并进行 聚类分析、物种多样性分析和物种分类学分析，每组均设定 个重复。统统计计学学分分析析 所有实验一式三份，结果用 软件表对数据进行分析。数据通过单变量方差分析（）进行评估，具有统计学意义。结果 发发酵酵液液 与与 变变化化 细菌 的变化显示了在发酵时珍国医国药 年第 卷第 期 过程中细菌数量的动态变化。如图 所示，对照组及连朴饮组细菌生长速度要明显快于黄连 厚朴药对组，在 内，对照组的发酵液 从（）增长至（），连朴饮组发酵液 从（）上升到（），而在黄连 厚朴药对组，发酵液 在发酵 内从（）增长到（）。结果表明，黄连 厚朴药组 的增长速度及最高值都显著低于对照组（），而连朴饮组细菌生长较快，但与对照组相比，没有显著性差异（）。发酵液的 动态变化是反应细菌生长过程中代谢能力的一个指标。如图 所示，在发酵 内，对照组发酵液的 值从下降至（），连朴饮组发酵液的 值从（）下降至（），黄连 厚朴药对组发酵液的 值从（）降低至（）。对照组与连朴饮组发酵液 的变化在 内要显著性高于黄连 厚朴药对组（），但连朴饮组与对照组相比，值变化差异不大（）。发酵不同时间点发酵液 变化 发酵不同时间点发酵液 值变化图 发酵不同时间段细菌 及发酵液的 变化 及及 多多样样性性分分析析 通过对人粪便发酵样品的菌群进行 进行分析，进一步了解连朴饮及黄连 厚朴药对对人体肠道菌群多样性、结构及组成的影响。发酵后菌群物种的多样性差异如图 所示，其中 均为 多样性，包括 指数、和 指数，指数代表群落丰度，代表了菌群的多样性。从柱状图中可以看出，黄连 厚朴药对组 指数、和 显著性低于对照组（），表明黄连 厚朴药对降低了菌群的丰富度，而连朴饮组与对照组相比并无显著性变化。，由图 可知，黄连 厚朴药对组菌群多样性高于对照组，但无显著性差异，连朴饮组菌群的多样低于对照组。为 多样性，代表了组间差异。从 图中可以看出，三个组的组内聚类较好，且不同组之间差异较大，表明药对及连朴饮改变了菌群的多样性。肠肠道道菌菌群群不不同同水水平平组组成成变变化化 发酵后，不同组中肠道菌群在门水平及属水平的变化如表 所示。在门水平，细菌的丰度主要集中于变形菌门（）、厚壁菌门（）、拟杆菌门（）及放线菌门（）。在属水平上，细菌的丰度主要集中于埃希氏 志贺氏菌属（）、肠球菌属（）、克雷伯氏菌属（）、拟杆菌属（）及双歧杆菌属（）。药对组与对照组比较，；连朴饮组与对照组比较，均为 多样性 ，为 多样性药对组与对照组比较，；连朴饮组与对照组比较，图 各组肠道菌群 及 多样性分析由表 可知，在门水平上，变形菌门为黄连 厚朴药对组中的优势菌，其含量为（），在发酵后，厚壁菌门、拟杆菌门及放线菌门的相对丰度显著性降低（）。连朴饮组增加了变形菌门的相对丰度，但与对照组相比，没有显著性差异（）。黄连厚朴药对组与连朴饮组相比，连朴饮组显著性增加了厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度（），降低了变形菌门的相对丰度（）。在属水平上，与对照组相比，黄连 厚朴药对组显著性降低了埃希氏 志贺氏菌属、肠球菌属、拟杆菌属及双歧杆菌属的相对丰度（）。黄连厚朴药对组与连朴饮组相比，连朴饮组则显著性增加了肠球菌属、拟杆菌属及双歧杆菌属的相对丰度（），显著性降低了克雷伯菌属的相对丰度（）。表 门水平及属水平肠道菌群变化丰度（?）分类对照组药对组连朴饮组门水平 变形菌门 厚壁菌门 拟杆菌门 放线菌门 其他 属水平 大肠 沙门氏菌属 肠球菌属 链球菌属 克吕沃尔氏菌属 肠杆菌属 拟杆菌属 克雷伯菌属 双歧杆菌属 乳酸菌属 其他 药对组与对照组比较，；连朴饮组与对照组比较，；药对组与连朴饮组比较，；药对组与连朴饮组比较，时珍国医国药 年第 卷第 期 各各组组菌菌群群 聚聚类类分分析析 通过聚类分析，将相似性超过的序列分配到同一 单元。对所获得的 物种信息进行标注，进一步分析不同组发酵后肠道菌群在门、科、属水平的变化。如图 所示，发酵后在黄连 厚朴药对组中双歧杆菌属（）、乳酸菌属（）等益生菌丰度显著性降低，而肠杆菌属（），克雷伯菌属（）等致病菌的丰度显著性上升（）。与对照组相比，在发酵后朴饮组中乳酸菌属的丰度显著性升高（），其它菌群变化不明显。图 各组菌群变化热图 菌菌群群属属水水平平 分分析析 是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征，并找到与丰度有显著性差异的类群的一种分析方法。如图 所示，经过发酵后，对照组肠道菌群的优势菌群占比最多，连朴饮组中的优势菌种主要为乳酸菌，而黄连 厚朴药对组的优势菌种主要为肠杆菌、溶果胶菌及变形菌。图 各组菌群在属水平上的 分析 讨论王氏连朴饮功效清热化湿、理气和中，组方以祛邪为主，苦寒中配以温燥之半夏，淡润之芦根，使全方祛邪不伤正。黄连 厚朴药对源自太平圣惠方“厚朴丸”，是临床常用药对之一，黄连苦寒，厚朴下气，可清热祛湿理气，但方中无和中之品，亦无扶正之药，故见两者药效存异。黄连 厚朴药对中，黄连含量为 ，厚朴含量为 。有研究表明，黄连包括小檗碱、黄连碱等成分，厚朴包括厚朴酚等成分，这些成分具有一定的抑菌作用。连朴饮中黄连、厚朴含量均为 ，与黄连 厚朴药对相比，黄连、厚朴含量减少。除此之外，连朴饮中还增加了豆豉、芦根等多味中药，这些中药共同作用能够维持肠道菌群的多样性。因此在发酵后，黄连 厚朴药对组中发酵液的低于对照组，肠道菌群的丰度显也著性降低，而连朴饮组发酵液的 及菌群丰度变化不明显。肠道菌群在人体健康中发挥着重要的作用，能够参与机体生长发育及调节机体免疫系统。肠道菌群在生长过程中可产生大量甲酸、乙酸、乳酸等有机酸，这些酸性物质使肠道呈酸性，进而抑制病原菌的生长。在本研究中，由于黄连 厚朴药对组中的抑菌成分抑制了菌群的生长，降低了乳酸菌、双歧杆菌、拟杆菌等益生菌丰度，使有机酸的含量降低，因此发酵液 下降减少。连朴饮能够维持肠道菌群生长速度及多样性，经过发酵后肠道菌群产生大量有机酸，因此发酵液 变化趋势较明显。综上所述，黄连 厚朴药对能够抑制双歧杆菌、拟杆菌等细菌的生长，促进克雷伯菌、肠杆菌等致病菌的生长，降低肠道菌群的丰度。连朴饮促进了乳酸菌、双歧杆菌等益生菌生长，能够维持肠道菌群稳定。这一研究结果不仅为连朴饮在临床上的使用积累数据，也为探索基于肠道菌群为靶点的药物干预来治疗和防御提供了理论基础。参考文献：谢 苗，邵文雪，张晓艳 连朴饮临床应用概述 河南中医，（）：王曦宇 连朴饮加减联合四联疗法治疗幽门螺杆菌相关性胃炎脾胃湿热证的临床研究 中国医药指南，（）：何学梅 王氏连朴饮加味治疗脾胃湿热型幽门螺杆菌相关慢性胃炎 例 浙江中医杂志，（）：王彩萍，张科防，苗慧霞，等 幽门螺杆菌相关性胃炎脾胃湿热证连朴饮加减联合四联疗法治疗临床效果分析 临床医药文献电子杂志，（）：周莉，廖华君，钟逸敏，等 王氏连朴饮治疗湿热病举隅 深圳中西医结合杂志，（）：孟金金 黄连苦寒成分体内代谢过程对药性的影响研究 抗感染药学，（）：王志强，宓 伟，刘现兵，等 厚朴体外抑菌作用研究 时珍国医国药