基于蛋白质半胱氨酸的活性蛋白表达谱分析_姜中尧.pdf

Univ.Chem.2023,38(1),119128 119 收稿：2022-03-09；录用：2022-05-17；网络发表：2022-05-23*通讯作者，Email: 基金资助：山东省自然科学基金项目(ZR201911140003)；国家自然科学基金项目(22134004)知识介绍 doi:10.3866/PKU.DXHX202203011 基于蛋白质半胱氨酸的活性蛋白表达谱分析基于蛋白质半胱氨酸的活性蛋白表达谱分析 姜中尧，牛雅新，王楠，陈蓁蓁*，唐波 山东师范大学化学化工与材料科学学院，分子与纳米探针教育部重点实验室，济南 250014 摘要：摘要：蛋白质中的半胱氨酸对维持和调控细胞内的氧化还原平衡起着重要作用，同时它们也是多种蛋白质的功能活性位点，参与诸多生理过程。此外，蛋白质中的半胱氨酸上所发生的一系列翻译后修饰也扩展了蛋白质功能的多样性。随着化学蛋白质组学的发展，基于活性的蛋白表达谱(Activity-based protein profiling，ABPP)分析技术在探究蛋白质半胱氨酸及其翻译后修饰方面取得了很多重要的研究成果。本文简要介绍了用于蛋白质半胱氨酸的活性蛋白表达谱分析方法，讨论了针对蛋白质半胱氨酸及其翻译后修饰的蛋白质组学领域的最新研究，并对该领域的未来发展趋势进行了展望。关键词：关键词：半胱氨酸；蛋白质翻译后修饰；活性蛋白表达谱；化学探针 中图分类号：中图分类号：G64；O657.6 Activity-Based Protein Profiling of the Functional Cysteinome Zhongyao Jiang,Yaxin Niu,Nan Wang,Zhenzhen Chen*,Bo Tang Key Laboratory of Molecular and Nano Probes(Ministry of Education),College of Chemistry,Chemical Engineering and Materials Science,Shandong Normal University,Jinan 250014,China.Abstract:Proteomic cysteines play important roles in maintaining and regulating redox homeostasis in cells;they also act as functional active site in many proteins and participate in many physiological processes.In addition,post-translationally modifying proteomic cysteines also extends protein functional diversity.The development of chemical proteomics and activity-based protein profiling(ABPP)has led to many important improvements that enable cysteines and their post-translational modifications to be explored.In this paper,we briefly introduce ABPP methods for the proteome-wide profiling of cysteines,present the latest proteomics research into protein-based cysteines and their post-translational modifications,and discuss future developmental trends in this field.Key Words:Cysteine;Protein post-translational modifications;Activity-based protein profiling;Chemical probes 1 活性蛋白表达谱分析活性蛋白表达谱分析(ABPP)蛋白质作为细胞、组织的重要成分，是生命过程中生理功能的重要执行者和生命现象的直接体现者，对蛋白质功能活性的研究将有助于阐明其对生理或病理过程的调控机制。蛋白质组学能够分析获取生命过程中成千上万种蛋白功能活性的信息，可以在大规模水平上鉴定蛋白质的表达水平、修饰水平、相互作用等。在后基因组时代，如何准确、快速地解析复杂生物体系内蛋白质的功能活性，揭示蛋白质参与生命活动的方式，了解这些功能活性的变化对生命过程产生的影响，已经成为120 大 学 化 学 Vol.38 蛋白质组学亟需解决的一个重要科学问题1。半胱氨酸(Cysteine，Cys)是存在于多数蛋白质中频次较低的氨基酸(1%2%)，但由于其侧链巯基的化学活泼性使其展现出较强的内在活性，也成为多种蛋白质的功能活性位点2。蛋白质半胱氨酸残基作为细胞内的还原性物质和与小分子介质作用的重要主体，对于维持和调控细胞内的氧化还原内环境起着重要作用3。它们参与调控细胞识别、信号转导等多种生理过程，并与生物体内还原性物质变化的相关疾病有着密切的联系4。此外，蛋白质半胱氨酸上的巯基对细胞内局部环境的变化很敏感，可以发生多种翻译后修饰的类型5，如硫巯化(S-sulfhydration，SSH)、亚硝基化(S-nitrosylation，SNO)、次磺酸化(S-sulfenylation，SOH)、亚磺酸化(S-sulfinylation，SO2H)、棕榈酰化(S-palmitoylation)、异戊二烯化(S-prenylation)等(图1)。这些翻译后修饰能够快速、动态地调控蛋白质的构型、活性，拓展生物体内蛋白质的功能多样性，并能够影响到人类许多重要疾病的发生发展。因此，对蛋白质半胱氨酸及其翻译后修饰的研究具有十分重要的生物学意义，一直是持续不断的科研热点。图图1 蛋白质半胱氨酸及其翻译后修饰类型蛋白质半胱氨酸及其翻译后修饰类型 近年来，质谱技术的迅速发展，为蛋白质研究提供了高通量、高灵敏和高分辨的分析平台，并已成为研究蛋白质组学最具突破性、应用最广泛的技术手段之一。利用不同化学探针对蛋白组中的活性位点进行标记，结合定量化学蛋白质组学的活性蛋白表达谱分析方法(ABPP)应运而生6。该方法致力于在复杂的生命体系中系统地鉴定某些具有特定功能的蛋白质分子(图2)，并且这些功能蛋白质的丰度往往不高，其他方法难以检测。ABPP方法利用化学活性探针共价连接某些蛋白质中的氨基酸位点，进一步利用探针中的报告基团进行富集，用于凝胶电泳分析或质谱分析鉴定被化学探针标记的蛋白组分以及潜在功能位点，进而揭示它们的分子功能7。近几年，针对蛋白质半胱氨酸及其翻译后修饰的ABPP方法的研究层出不穷。目前已有多种不同类型的化学探针被开发出来，用于捕获蛋白质半胱氨酸及其翻译后修饰的活性位点；同时研究人员也通过这些方法发现了一些蛋白质未被报道过的功能和翻译后修饰类型，并对这些蛋白在体内发挥的作用有了更加深入的认识。本文将对近年来开展的基于蛋白质半胱氨酸及其翻译后修饰的活性蛋 图图2 ABPP探针的结构以及用于蛋白质凝胶电泳分析与质谱检测探针的结构以及用于蛋白质凝胶电泳分析与质谱检测 No.1 doi:10.3866/PKU.DXHX202203011 121 白表达谱分析方法的进展情况进行综述，详细探讨其作用原理、优缺点和应用范围，并探讨ABPP方法发展的走向及其未来可能的拓展应用。2 针对蛋白质半胱氨酸的针对蛋白质半胱氨酸的ABPP方法方法 2.1 IA-alkyne探针标记蛋白质半胱氨酸的探针标记蛋白质半胱氨酸的isoTOP-ABPP 碘乙酰胺的炔基衍生化探针(IA-alkyne)是一种在ABPP中应用十分广泛的亲电小分子探针，其反应基团主要与蛋白质半胱氨酸残基中的巯基共价交联，标签基团通过点击反应偶联荧光团或者生物素，进而对靶向的蛋白质进行可视化检测与富集。同位素标记串联正交水解酶-活性蛋白表达谱方法(isotopic tandem orthogonal proteolysis-ABPP，isoTOP-ABPP)是目前主要用于活性蛋白表达谱分析的定量方法，是一种在复杂的生物系统中直接探究蛋白质活性的开创性技术(图3a)8。isoTOP-ABPP方法使用IA-alkyne探针标记蛋白质半胱氨酸进行定量化学蛋白组学分析主要包括以下步骤：(1)用IA-alkyne处理细胞裂解物以标记活性半胱氨酸(图3b)；(2)使用铜催化的叠氮-炔烃环加成反应(Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition，CuAAC)将对照和实验样品中IA-alkyne标记的半胱氨酸蛋白与同位素化的可裂解生物素-叠氮化物标签偶联(图3c)；(3)在链霉亲和素珠上富集IA-alkyne标记的蛋白，然后进行胰酶消化，并进行linker切割以释放IA-alkyne标记的肽；(4)使用液相色谱-串联质谱联用技术(Liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS)分析所得的同位素标记的轻、重肽对，以轻重肽段的峰面积比值对两个样品的反应活性差异进行定量。图图3 isoTOP-ABPP技术技术(a)isoTOP-ABPP平台工作流程；(b)IA-alkyne对巯基的标记；(c)isoTOP-ABPP的TEV蛋白酶可裂解的生物素-叠氮化物标签 2010年，Scripps研究所Benjamin F.Cravatt教授课题组利用不同浓度的IA-alkyne探针对生理条件下的蛋白组裂解液进行标记，通过isoTOP-ABPP方法(图4)系统地分析了MCF-7等多种人类癌症细胞系和小鼠组织的蛋白组内半胱氨酸的内在反应性，并发现半胱氨酸的内在反应活性与其功能具有非常明显的关联性9。该方法不仅可以对已知功能蛋白酶催化中心的半胱氨酸的活性进行监测，还发掘出一大批内在化学反应活性很高、功能尚待研究的半胱氨酸位点。基于之前的研究基础，该课题组利用isoTOP-ABPP策略的位点特异性识别和定量能力，开发了一种竞争性的isoTOP-ABPP策略来鉴定脂质衍生亲电试剂(lipid-derived electrophiles，LDEs)诱导的半胱氨酸修饰。LDEs能够共价修饰蛋白质中的半胱氨酸，因此能够与IA-alkyne探针进行竞争标记。LDEs对蛋白质中半胱氨酸的修饰程度最终通过isoTOP-ABPP策略的定量比值表示出来。研究人员通过几组平行实验的定量结果，精确地鉴定到了几种LDEs修饰的半胱氨酸位点，并揭示出了一些对LDEs具有高反应活性的半胱氨酸残基10。此外，该策略还被拓展到鉴定微生物衍生的活性代谢物二肽醛对蛋白组中半胱氨酸的修饰11。122 大 学 化 学 Vol.38 图图4 基于基于isoTOP-ABPP的方法测定蛋白质组中半胱氨酸反应活性的方法测定蛋白质组中半胱氨酸反应活性9 值得注意的是，竞争性isoTOP-ABPP策略不仅可用于研究代谢产物对蛋白组中半胱氨酸的修饰，而且还可用于研究天然产物或共价药物所修饰的半胱氨酸12,13。例如，Withaferin A是一种已知具有癌症抗增殖活性的亲电性天然产物。Grossman等人评估了Withaferin A的靶向蛋白组的反应活性，表明Withaferin A激活了肿瘤抑制酶磷酸酶PP2A 12。Whitby等人通过isoTOP-ABPP方法研究了用肝毒性药物如对乙酰氨基酚、曲格列酮、氯氮平和亚硝酸处理后，体内产生的反应性代谢产物对蛋白质组的标记14。同时该策略也被用来评估小分子片段库中小分子标记半胱氨酸的反应活性，并从大量被认为不具