基于靶向NLRP3炎症小体...肝病活性成分发现及机制研究_沈廷明.pdf

1498 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 基于靶向NLRP3炎症小体的金线莲治疗代谢相关脂肪性肝病活性成分发现及机制研究 沈廷明1，颜于露1，叶希奇1，黄春情1，吴军军1，方 芝1，王英豪2，沈悰祺3，吴荔芬4*1.宁德市中医院，福建 宁德 352100 2.福建中医药大学，福建 福州 350122 3.山西中医药大学，山西 太原 030024 4.莆田学院附属医院，福建 莆田 351100 摘 要：目的 探索靶向 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎症小体的中药活性成分发现及机制。方法 以金线莲 Anoectochilus roxburghii 治疗代谢相关脂肪性肝病（metabolic-related fatty liver disease，MAFLD）为例，通过网络药理学方法结合 Western blotting 研究金线莲靶向调控 NLRP3 炎症小体的活性成分。结果 发现并验证了木犀草素、槲皮素可以抑制核因子-B（nuclear factor-B，NF-B）信号通路的活化，同时验证了木犀草素可以抑制 NLRP3 炎症小体的激活。结论 阐释了金线莲发挥抗 MAFLD 的物质基础及效应机制，为防治NLRP3 炎症小体相关疾病提供了潜在的候选药物，同时为金线莲及相关制剂的有效性评价、质量控制和资源开发提供了科学依据。关键词：NLRP3 炎症小体；代谢相关脂肪性肝病；金线莲；网络药理学；槲皮素；木犀草素 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253-2670(2023)05-1498-08 DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2023.05.016 Discovery and mechanism of active ingredients of Anoectochilus roxburghii in treatment of metabolic-related fatty liver disease based on targeting NLRP3 inflammasome SHEN Ting-ming1,YAN Yu-lu1,YE Xi-qi1,HUANG Chun-qing1,WU Jun-jun1,FANG Zhi1,WANG Ying-hao2,SHEN Cong-qi3,WU Li-fen4 1.Ningde Hospital of Traditional Chinese Medicine,Ningde 352100,China 2.Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China 3.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030024,China 4.Affiliated Hospital of Putian College,Putian 351100,China Abstract:Objective To explore the active ingredients and mechanism of traditional Chinese medicine targeting NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3(NLRP3)inflammasome.Methods Anoectochilus roxburghii was taken in treatment of metabolic-related fatty liver disease(MAFLD)as an example,network pharmacology combined with Western blotting were used to study the active components of A.roxburghii targeting and regulating the NLRP3 inflammasome.Results Luteolin and quercetin could inhibit the activation of nuclear factor-B(NF-B)signaling pathway,and luteolin could inhibit the activation of NLRP3 inflammasome.Conclusion The research results strongly explain the material basis and effector mechanism of anti-MAFLD,provide potential candidates for the prevention and treatment of NLRP3 inflammasome-related diseases,and provide scientific basis for the effectiveness evaluation,quality control and resource development of A.roxburghii and related preparations.Key words:NLRP3 inflammasome;metabolic-related fatty liver disease;Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl;network pharmacology;quercetin;luteolin 收稿日期：2022-09-09 作者简介：沈廷明（1975），男，主任药师，主要从事医院药学研究。Tel:15160187288 E-mail:*通信作者：吴荔芬，副主任药师，主要从事临床中药学研究。Tel:18206018616 E-mail: 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 1499 非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在排除酒精和其他明确原因的情况下，由代谢紊乱诱发肝脏出现肝细胞内脂质过度沉积的一种慢性肝病1。脂质在肝脏中异常聚集会导致肝脏正常生理功能受损，严重的会导致肝脏纤维化、肝硬化、肝脏坏死。2020 年专家组织在共识声明中提议将非酒精性脂肪性肝病更名为代谢相 关 脂 肪 性 肝 病（metabolic-related fatty liver disease，MAFLD）2。MAFLD 全球患病率持续上升，对人类健康造成严重威胁。目前，西医尚无治疗 MAFLD 的药物，而中医药作为我国传统医学，在治疗 MAFLD 方面有独特疗效，显现出巨大的优势和开发应用前景。金线莲 Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl 为兰科开唇兰属的一种多年生草本植物，含有多种化学成分，包括黄酮类、多糖类、生物碱等3。现代研究表明，金线莲具有抗肿瘤、降血糖、保肝等药理作用4。近年来，金线莲及其提取物在治疗 MAFLD方面体现出一定的疗效5。本研究运用网络药理学方法6探讨金线莲治疗 MAFLD 的作用机制，揭示金线莲防治 MAFLD 在靶点-通路层面的复杂分子机制，为金线莲治疗 MAFLD 的作用机制探究提供新思路和新方向。1 材料 1.1 动物 SPF 级 C57BL/6 雌性小鼠，78 周龄，体质量（202）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物合格证号 NO.110324210105903262。动物饲养于温度 2224、相对湿度（555）%、12 h 光暗循环的环境下，自由进食饮水。动物实验伦理批准号 IACUC-2021-0008。1.2 药品与试剂 槲皮素（批号 HY-18085，质量分数为 98.02%）、木犀草素（批号 HY-N0162，质量分数为 98.49%）、小鼠巨噬细胞集落刺激因子（批号 HY-P7085）购自MedChemExpress 公司；DMEM 培养基（批号CM10013）购自中科迈晨；Opti-MEM 培养基（批号 31985-070）购自美国 Gibco 公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购自 Invivogen 公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP，批号 A2383）购自美国 Sigma-Aldrich 公司；NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗体（批号15101S）、白细胞介素-1 前体（interleukin-1 precursor，pro IL-1）抗体（批号 12242S）购自美国 CST 公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 前体（cystein-asparate protease-1 precursor，pro Caspase-1）抗体（批号 AG-20B-0042）购自 Adipogen 公司；凋亡斑点样蛋白（apoptotic spot-like protein，ASC）抗体（批号 sc-22514-R）购自Santa Cruz Biotechnology；IL-1 抗体（批号 12703S）购自 R&D systems；Lamin B 抗体（批号 66095-1-Ig）购自 Proteintech 公司；驴抗小鼠二抗（批号 115-035-003）、驴抗兔二抗（批号 111-035-003）、驴抗羊二抗（批号 705-035-003）购自 Jackson Immuno Research。1.3 仪器 3-18K 型离心机（美国 Sigma 公司）；RX-N-C型显影胶片（广西巨星医疗器械有限公司）；JY-JX5+型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；HERAcell vios 160i 型培养箱（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）。2 方法 2.1 金线莲活性成分筛选 从 PubChem 数据库（https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取金线莲化学成分 2D 结构及 smile 式，进 一 步 通 过 SwissADME 数据库（http:/www.swissadme.ch/）筛选出其潜在的活性成分，通过SwissTargetPrediction 数据库（http:/www.swisstarget prediction.ch/）对潜在的作用靶点进行预测，结合UniProt数据库（https:/www.uniprot.org/）进行转换。2.2 MAFLD 疾病靶点筛选 以“metabolic associated fatty liver disease”为关键词在 Drugbank 数据库（https:/ 数据库（http:/ Disgenet 数据库（http:/www.disgenet.org）中检索得到疾病靶点，通过 UniProt 数据库（https:/www.uniprot.org）进行转换。2.3 “活性成分-MAFLD”网络的构建 利用 Venny 图得到金线莲活性成分与 MAFLD的交集靶点，导入 Cytoscape 3.8.2 软件构建“活性成分-M