基于丁酸功能化基团钌化合物的合成及其抗菌活性研究_曾威.pdf

化学试剂 第 卷第 期基于丁酸功能化基团钌化合物的合成及其抗菌活性研究曾威，丁云霞，姜雯雯，陈晓燕，荣小娟，马兆霞（江西科技学院 医学院，江西 南昌）摘要：以含丁酸取代的邻菲啰啉衍生物为主配体（）合成了两个新型抗菌钌化合物（）（）（）、（）（）（），通过最低抑菌浓度、时间杀伤曲线、溶血毒素试验、棋盘联用实验等评价了钌化合物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。采用 染色试验、（）膜去极化染色试验、泄露试验、内膜渗透性实验及活性氧监测（）试验验证了化合物 的抑菌机制。最后通过大蜡螟幼虫感染模型研究了 的体内抗菌活性。结果表明，两个钌配合物均具有显著的抗菌活性（.），钌化合物（.）能通过破坏细菌细胞膜并诱导产生 杀死细菌。此外，不仅能有效抑制细菌毒素的分泌，而且与部分抗生素具有协同抗菌活性（.）。更为重要的是，能显著提高细菌感染后大蜡螟幼虫的存活率（）。研究结果表明，基于丁酸功能化配体的钌化合物具有显著的抗菌活性。关键词：钌配合物；丁酸；抗菌机制；金黄色葡萄球菌中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，）：（）（）（），（）（）（），（.）（.），（.），：；收稿日期：；网络首发日期：基金项目：江西省教育厅科技项目（）；江西省卫健委科技计划项目（）。作者简介：曾威（），男，江西九江人，硕士，讲师，主要研究方向为抗菌活性物质的设计与筛选，：。引用本文：曾威，丁云霞，姜雯雯，等基于丁酸功能化基团钌化合物的合成及其抗菌活性研究化学试剂，（）：。多重耐药性细菌的广泛传播对全球公共卫生安全造成了巨大威胁，。全球每年因耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（）感染导致的死亡人数超过了 万。而开发出具有全新作用机制的抗菌药物是应对多重耐药菌的手段之一。研究表明，具有细菌膜破坏作用的抗菌剂不仅抗菌活性高，而且细菌不容易产生耐药性。其中抗菌多肽作为一种典型的膜靶向分子受到了广泛关注。然而体内稳定性差、合成成本高等缺点严重制约了抗菌多肽的临床应用。设计合成具有抗菌多肽类似作用的有机小分子可以有效地解决这些缺陷，因此开发具有膜破坏作用的有机小分子代替抗菌肽被认为是一种有前途的抗菌策略。有机丁酸不仅广泛用于各种药物活性中间体的合成，而且丁酸类化合物本身也具有多样的生物活性，如抗肿瘤、抗菌活性等。研究表明，短链脂肪族丁酸发挥抗菌作用与靶向细菌细胞膜密切相关。相比于传统有机小分子化合物，金属配合物具有多靶点、不容易诱导细菌产生耐药性等特点。因此，金属化合物在抗菌方面的应用受到了广泛第 卷第 期曾威等：基于丁酸功能化基团钌化合物的合成及其抗菌活性研究关注，而钌化合物是研究最为广泛的金属类抗菌化合物之一。钌化合物不仅对各类病原菌呈现出显著的抑菌活性，而且对多重耐药性病原菌同样具有很好的抗菌活性。基于钌化合物在抗菌方面的优势，本文将有机小分子丁酸整合到金属钌化合物中，并成功合成了两个具有破坏细菌细胞膜完整性的钌基抗菌剂：（）图 中间体及钌配合物的合成路线 （）（）、（）（）（）。通过最低抑菌浓度（）和时间杀伤曲线的测定初步测定了两个化合物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。随后通过 染色实验、核酸及酶泄露实验、细菌膜电位监测以及细菌内 的监测等实验验证了化合物的抗菌机制。此外，还通过溶血毒素分泌实验以及棋盘联用实验进一步验证了 的抗菌活性。最后通过大蜡螟幼虫感染模型评价了 的体内抗菌活性。实验部分.主要仪器与试剂 型超导核磁共振仪（美国 公司）；型 高 分 辨 率 质 谱 仪（美 国 公司）；型 荧光显微镜（德国 公司）。对羟基苯甲醛、溴丁酸甲酯、三氟乙酸（分析纯，萨恩科学技术有限公司）；冰醋酸、醋酸铵、碳酸钾（化学纯，西陇科学股份有限公司）；苯胺、，二甲基甲酰胺（分析纯，上海安耐吉化学有限公司）；所有试剂使用时无需进一步纯化。金黄色葡萄球菌（中国工业微生物菌种保藏中心）。.化合物的合成.中间体 的合成中间体 的合成是根据文献报道的路线。.配体 的合成在 的反应管中加入.（）中间体、，二甲基甲酰胺、.（）碳酸钾、.（.）溴丁酸甲酯后搅拌回流 。反应结束后冷却到室温，加入 水后析出大量棕黄色沉淀。过滤收集沉淀后真空干燥得到棕黄色粉末。将粗产物溶解在 混合溶液（水）（二氯甲烷）后继续加入三氟乙酸，在 继续回流 。反应结束后加入 水后析出棕黄色沉淀。过滤收集沉淀后真空干燥得到.棕黄色粉末，产率。（，），：.（，）；.（，）；.（，）；.（，）；.（，）；.（，）；.（，.，）；.（，）；.（，）；.（，）。（，），：.（）；.（）；.（）；.（）；.（，.）；.（）；.（，.）；.（，.）；.（，化学试剂 第 卷第 期.）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）。（），实测值（计算值），：.（.）。.化合物 的合成 反应瓶中加入.（.）（）、.（.）、乙二醇，在 氮气保护下搅拌回流 。反应结束后加入 饱和六氟磷酸钾溶液，得到红色固体沉淀。粗产物经中性氧化铝柱（乙腈）（二甲苯）分离纯化，洗脱液减压蒸馏后得.红色粉末，产率。（，），：.（，）；.（，.，）；.（，）；.（，.，）；.（，）；.（，）；.（，.，）；.（，）；.（，）；.（，）；.（，.，）；.（，）；.（，）；.（，）；.（，）；.（，）；.（，.，）；.（，）。（，），：.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（，.）；.（）；.（，.）；.（）；.（）；.（）；.（，.）；.（，.）；.（）；.（，.）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）。（），实测值（计算值），：.（.）。.化合物 的合成化合物 的合成方法与化合物 的合成方 法 相 同，用 （）取 代（），得.化合物，产率。（，），：.（，）；.（，.，）；.（，）；.（，）；.（，.，）；.（，.，）；.（，.，）；.（，），.（，）；.（，）；.（，）；.（，）；.（，）；.（，）。（，），：.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）；.（）。（），实 测 值（计 算 值），：.（.）。.抗菌活性测试.最低抑菌浓度与时间杀伤曲线处于对数期的金黄色葡萄球菌用新鲜 培养基稀释 倍后得到细菌混悬液，然后将 含梯度浓度的钌化合物（.）与 细菌悬液加入到 孔平板中，在 培养 后观察最低抑菌浓度数值。对于时间杀伤曲线的绘制，将不同浓度的钌化合物与细菌混悬液在 共同孵育，在指定的时间点将细菌悬浮液稀释 倍并涂布在培养平板上，下培养 后对菌落进行计数。.染色实验细菌染色实验根据文献实验方法开展。将处于对数期的金黄色葡萄球菌离心收集，清洗 次后用 缓冲液稀释至 备用。将（、）加入到细菌混悬液中 孵育 。分别取 （），二脒基苯基吲哚（）和 （）碘化丙啶（）加入到细菌悬液中，常温孵育 后，用共聚焦荧光显微镜成像。.细胞质膜去极化实验收集对数期生长的金黄色葡萄球菌，用 缓冲液稀释至 。加入（、）后在 下孵育 。然后离心收集细菌，洗涤 次后重悬于 缓冲液中，加入 （）（）荧光染料，黑暗条件下孵育 后，通过共聚焦荧光显微镜成像。.内膜渗透性实验金黄色葡萄球菌在含.乳糖的 培养基中培养过夜，离心收集细菌后用 重悬细菌。取 细菌悬液、药物溶液以及 邻硝基酚半乳糖苷（）加入到 摇菌管中，用紫外分光光度计测定混合液在 处的吸光度值。.核酸泄露实验收集对数期生长的细菌，洗涤 次后重悬于 缓冲液中。加入（、）孵育不同时间后，取细菌混悬液经用.的滤膜过滤细菌。过滤液用紫外分光光度计监测在 处的吸光度值。.监测不同浓度的（、）与细菌在第 卷第 期曾威等：基于丁酸功能化基团钌化合物的合成及其抗菌活性研究 下孵育 ，然后用 洗涤 次后重悬细菌。加入最终浓度为 的，二氯荧光素二乙酸酯（）染料后在 继续孵育。然后 离心 收集细菌，用 洗涤 次后使用共聚焦显微镜进行成像。.兔红细胞溶血实验过夜培养的细菌用新鲜 培养基稀释 倍后，加入钌配合物后继续培养 。离心收集上清液后，取 细菌上清液和 的兔血细胞加入到 的 缓冲液中。下孵育 后离心收集上清液，在 处测定上清液的吸光度值。.棋盘联用实验将 含不同浓度的、不同浓度的抗生素和 细菌悬浮液（制备方法见最低抑菌浓度的测试）加入到 孔平板中，随后在 恒温培养箱中培养 测定化合物各自的 值。两种药物的联用效果可用分级抑制浓度指数（）评价，当.时表示具有协同作用。.大蜡螟幼虫细菌感染模型离心收集对数期生长的细菌，然后用 缓冲液将细菌稀释至 .，所有大蜡螟幼虫随机分为 组（每组 只）并用 的酒精对注射部位消毒。大蜡螟幼虫右后腹足处注射 细菌混悬液，后从大蜡螟幼虫左后腹足注射（、）不同浓度的 和 万古霉素。监测 内大蜡螟幼虫的存活率。结果与讨论.体外抗菌活性本文以丁酸取代的邻菲啰啉衍生物为主配体合成了两个新型钌化合物，化合物的结构通过高分辨率质谱、核磁共振氢谱和碳谱进行了表征。通过最低抑菌浓度（）的测定评价了两种化合物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，化合物、的 值分别为.、.。值得注意的是，化合物 的抗菌活性明显高于庆大霉素（.）。这一结果表明两个钌化合物具有显著的抗菌活性（见表）。为了进一步 表 钌化合物及常用抗生素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度 化合物庆大霉素（）.曲线 的浓度分别为、.、；图 不同钌化合物对金黄色葡萄球菌的时间杀伤曲线 化学试剂 第 卷第 期研究钌化合物的杀菌作用，将不同浓度的钌化合物与金黄色葡萄球菌共同孵育，然后在不同时间点监测活细菌的数量。结果显示两种钌化合物（.）处理 后，存活的细菌数量明显减少。化合物（）能在 内杀死的金黄色葡萄球菌（图）。以上结果表明，目标钌化合物不仅可以有效抑制细菌的生长，而且还可以起到快速杀菌的作用。.钌化合物的抑菌机制考虑到化合物 具有较强的抑菌活性，以 为研究对象进一步研究钌化合物的抑菌机制。首先，通过 以及 染色实验监测了细菌细胞膜的完整性。作为常见的荧光染料，与 结合并显示出强烈的蓝色荧光，因此 处理后细菌会产生蓝色荧光。然而 染料只能穿过受损的细胞膜，其进入细胞内与 结合后产生红色荧光。结果显示，处理后的细菌呈现出强烈的蓝色和红色荧光，而未处理组仅显示蓝色荧光，这表明 能有效破坏细菌细胞膜的完整性（图）。随后，通过（）荧光探针进一步监测了 处理后细菌细胞膜电位的变化情况。（）是一种膜去极化探针，与细胞膜磷脂双分子层结合后荧光会淬灭，当细胞膜破损时会导致膜电位发生变化，因此（）染料会从细胞膜磷脂双分子层中释放出来而发生绿色荧光。如图 所示，处理后的细菌呈现出显著的绿色荧光，这说明细菌细胞膜破坏后导致膜电位去极化。以 处理的细菌为对照组经 和 染色；经（）染色图 不同浓度 处理后细菌经染色后的荧光成像图 细菌的细胞膜破损后，细菌内容物如核酸与蛋白质等会泄露到细胞外，因此监测了细菌内部核酸 以 及 半 乳 糖 苷 酶 的 泄 漏 量。核 酸（，）在 处有最大吸收，而邻硝基第 卷第 期曾威等：基于丁酸功能化基团钌化合物的合成及其抗菌活性研究酚半乳糖苷（）可以监测 半乳糖苷酶的泄露情况。半乳糖苷酶能催化 生成黄色的邻硝基酚，邻硝基酚在 处有最大吸收。实验结果显示，在化合物 作用下细菌培养液在 处的吸收显著上升，提示邻硝基酚的大量生成。这说明 半乳糖苷酶已经从细菌体内泄露出来（图）。此外，经化合物 处理后，细菌培养上清液在 处的吸收同样明显增加，这提示细菌内核酸的泄露（图）。以上结果表明，通过破坏细菌细胞膜的完整性导致细胞内核酸和 半乳糖苷酶的泄漏。曲线 为空白对照组，曲线 为万古霉素处理组，曲线、为 处理组，浓度分别为、图 通过邻硝基酚半乳糖苷（）的转化生成邻硝基酚来监测细菌内 半乳糖苷酶的泄露情况；细菌培养上清液中核酸的含量；，二氯荧光素二乙酸酯（）检测细胞内 生成 ；，（）研究表明通过诱导活性氧（）的产生是许多药物杀菌的机制之一。为了进一步验证钌化合物是否同样能诱导产生，利用，二氯二氢荧光素二乙酸酯（）作为荧光探针监测了细菌体内 的生成情况。细胞内活