基于UHPLC-QTOF-...选紫菀中润肠通便的效应成分_吴浩.pdf

中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 1377 基于 UHPLC-QTOF-MS/MS 和分子对接筛选紫菀中润肠通便的效应成分4 吴 浩1，黄蓓蓓1，贾志鑫1，刘 洁1，陈奕君2*，肖红斌1*1.北京中医药大学，北京 100029 2.广州中医药大学，广东 广州 510006 摘 要：目的 通过 UHPLC-QTOF-MS/MS 和分子对接技术阐明紫菀 Aster tataricus 中润肠通便作用的效应成分。方法 采用 UHPLC-QTOF-MS/MS 技术分析体内肠道内容物的成分，再利用 SYBYL-X 2.0 与 Discovery Studio 4.0 分子对接软件研究肠道内容物成分与 M2 受体、M3 受体、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）蛋白的相互作用，明确各成分与靶标蛋白的结合强度。结果 体内肠道内容物中共鉴定出 28 个紫菀中的化学成分，有 10 个成分均可与 M2 受体、M3 受体及 PKC 蛋白分子对接较好，其中 astin J 与 3 种靶标蛋白结合的平均打分值最高，这些成分均以非共价键方式与靶标蛋白结合，产生氢键、范德华力、经典作用力等相互作用。结论 紫菀中的 astin J、asterin F、asterin A、异绿原酸 A、异绿原酸 B、异绿原酸 C、绿原酸、槲皮素、山柰酚和木犀草素共 10 个成分可能是通过调节 M 受体及其下游信号通路 PKC 蛋白的表达发挥润肠通便的作用。关键词：紫菀；肠内容物；靶标蛋白；分子对接；通便；astin J；asterin F；asterin A；异绿原酸 A；异绿原酸 B；异绿原酸 C；绿原酸；槲皮素；山柰酚；木犀草素 中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253-2670(2023)05-1377-09 DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2023.05.004 Screening effective components of laxative activity in Aster tataricus by UHPLC-QTOF-MS/MS and molecular docking WU Hao1,HUANG Bei-bei1,JIA Zhi-xin1,LIU Jie1,CHEN Yi-jun2,XIAO Hong-bin1 1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China 2.Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China Abstract:Objective To elucidate the effective components of laxative activity of Ziwan(Aster tataricus)by UHPLC-QTOF-MS/MS and molecular docking techniques.Methods UHPLC-QTOF-MS/MS technology was used to analyze the components of intestinal contents in vivo,and SYBYL-X 2.0 and Discovery Studio 4.0 molecular docking software were used to study the interaction of intestinal contents with M2 receptor,M3 receptor and PKC proteins.The binding strength of each component to the target protein was determined.Results A total of 28 chemical constituents were identified in the intestinal contents of A.tataricus,and 10 of them were well docked to the M2 receptor,M3 receptor and PKC proteins.Astin J had the highest average score for binding to the three target proteins,and all of them were non-covalently bound to the target proteins,to generate hydrogen bonds,van der Waals forces,classical forces and other interactions.Conclusion Astin J,asterin F,asterin A,isochlorogenic acid A,isochlorogenic acid B,isochlorogenic acid C,chlorogenic acid,quercetin,kaempferol and luteolin of A.tataricus may play a role in laxative activity by regulating the expression of M receptor and PKC proteins in the signaling pathway.Key words:Aster tataricus L.f.;intestinal contents;target protein;molecular docking;laxative;astin J;asterin F;asterin A;isochlorogenic acid A;isochlorogenic acid B;isochlorogenic acid C;chlorogenic acid;quercetin;kaempferol;luteolin 收稿日期：2022-09-07 基金项目：国家自然科学基金项目（81774155）；国家自然科学基金项目（81803703）；国家中医药传承创新项目（ZYYCXTD-C-202201）；北京中医药大学创新创业项目（2020-JYB-XSCXCY-089）作者简介：吴 浩（1995），男，硕士，研究方向为中药药效物质基础与作用机制。Tel:17862954633 E-mail:*通信作者：陈奕君，博士，助理研究员。Tel:(020)39358083 E-mail: 肖红斌，博士，教授。Tel:(010)64286490 E-mail: 1378 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 随着生物学和计算机科学等现代科学技术的发展，分子对接已成为药物靶点和药效成分筛选有力的工具，其原理就是利用计算机科学技术的相应的计算方法模拟分子的空间结构和分子间的相互作用力，通过研究分子间的空间作用力，寻找配体与受体活性位点的最佳结合方式的过程，在药物的研发中发挥着越来越重要的作用1-2。同时，得益于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）的发展及其高分辨率、高灵敏度、高选择性等优势，可通过优化超高效液相色谱的色谱柱、流动相、洗脱条件等方式，结合四极杆飞行时间质谱中全面的数据采集方法及数据后处理分析策略，例如前体离子扫描，关键产物离子鉴别等，实现中药单味药、复方提取物及体内微量成分的准确高效全面的识别，为中药（复方）成分及其代谢产物的分析及鉴定提供了有效的助力3-4。紫菀为菊科（Compositae）多年生草本植物紫菀 Aster tataricus L.f.的干燥根及根茎，别名青菀、返魂草、小辫等，生长于海拔 4002000 m 的山坡湿地、低山草地及沼泽地等；在我国分布十分广泛，主产于山西、河北、东北、内蒙古东部等地区，也分布在朝鲜、日本等国。紫菀具有宣通肺气、润肠通便的功效，在临床上常配伍薏苡仁、桔梗、杏仁、枳壳、葶苈子等使用治疗术后便秘、肠痈等。现代药理学研究表明，紫菀还具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化活性、化痰止咳平喘等作用5-19。前期研究发现紫菀润肠通便的作用机制与细胞膜上的 M 受体及钙离子通道有关20，但是对于紫菀中发挥作用的确切效应成分尚不清楚，需要进一步深入的研究。因此，本研究将通过 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 技术分析给药紫菀后的肠道内容物成分，针对与调节肠道的运动及平滑肌的收缩相关的 M2、M3 受体蛋白和其下游信号通路中的蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）蛋白，采用分子对接技术筛选与受体蛋白结合性较好的中药单体成分，进而阐明紫菀中润肠通便的效应成分，为后期的深入研究以及新药开发提供参考。1 材料与方法 1.1 动物与试剂 本研究中使用的动物方案由北京中医药大学动物伦理审查委员会（批准号 No.4-2018010103-10045）基于伦理程序和科学护理对其进行审核和批准。SD大鼠（180220 g）购自北京维通利华动物科技有限公司。所有的动物均被饲养在恒温（252），相对湿度（5010）%和12 h 光/暗周期的环境下。乙腈，LC/MS 级，Fisher 公司；甲醇，LC/MS级，Fisher 公司；甲酸，LC/MS 级，Sigma 公司；去离子水，Milli-Q 水净化系统自制；对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司，色谱纯，质量分数98%以上。紫菀药材购自北京同仁堂药业有限公司，经北京中医药大学王学勇教授鉴定为紫菀 A.tataricus L.f.的干燥根及根茎，药材（CMAT-AT-201904）存放在北京中医药大学中医药研究院中药分析与转化研究中心。1.2 样品的制备 1.2.1 紫菀药材提取液的制备 紫菀药材 200 g，料液比 110，50%的乙醇回流提取 2 次，煮沸后，保持微沸 1.5 h，用 200 目滤布滤过，合并续滤液，用旋转蒸发仪（温度 60、转速 45 r/min）旋蒸至无醇味，得质量浓度为 0.8 g/mL（生药量）的紫菀提取液。1.2.2 肠道内容物供试品溶液的制备 SD 大鼠，3只，禁食 18 h 后，ig 0.8 g/mL 的紫菀提取液，30 min后，水合氯醛麻醉，取出整段小肠，将肠内容物放入 15 mL 离心管中，涡旋 5 min 混匀，超声处理 15 min，高速离心 15 min（12 000 r/min、4），取上清液；加入 4 倍量乙腈沉蛋白，涡旋 5 min 后，高速离心 15 min（12 000 r/min、4），取上清液，过 0.22 m 微孔滤膜；用真空旋转浓缩仪浓缩至干，50%的甲醇 200 L 复溶，涡旋 5 min 后，高速离心15 min（12 000 r/min、4），取上清液，稀释 10倍检测。1.3 样品分析 液相色谱条件：样品的分离采用 ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm2.1 mm，1.8 m，Waters公司），柱温箱设定为 30，检测波长设定为 220、254、275、315 和 360 nm；流动相为 0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：01 min，5%B；15 min，5%15%B；515 min，15%30%B；1523 min，30%75%B；2325 min，75%95%B，进样体积为 2 L，体积流量为 0.4 mL/min。质谱条件：电喷雾离子源（ES