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中国中医急症 2023年1月第32卷第1期JETCM.Jan.2023，Vol.32，No.1 研究报告 基于 Wnt/-catenin 通路探讨通心络胶囊对ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠炎症水平的影响姜雪娇1李金霞2张秋云1宗文静3（1.首都医科大学，北京 100069；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.中国中医科学院中药研究所，北京 100700）中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1004-745X（2023）01-0043-04doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2023.01.009【摘要】目的 探究通心络胶囊对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成的影响及其通过Wnt/-catenin信号通路产生的作用机制。方法 将24只ApoE-/-小鼠随机分为正常饮食组（n=6）及高脂饮食组（n=18）。高脂饮食组喂养8周后，随机分为阿托伐他汀组（n=6）、通心络胶囊组（n=6）、模型组（n=6），并分别给予阿托伐他汀4.8 mg/kg、通心络胶囊超微粉1.5 g/kg以及同体积的生理盐水，每日1次，持续8周。末次给药后禁食12 h，收集各组小鼠主动脉组织进行苏木素-伊红（HE）及油红O染色，观察主动脉斑块情况；收集小鼠血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测肿瘤坏死因子-（TNF-）和白细胞介素-6（IL-6）的含量；并通过蛋白免疫印迹法（Western blotting）和实时荧光定量聚合物酶链式反应（Real-time PCR）检测主动脉组织中Wnt1、Wnt3a、-catenin蛋白及基因表达量的变化。结果 与正常组相比较，模型组小鼠的斑块面积明显增加，血清中的炎症因子TNF-和IL-6含量增加。与模型组相比较，通心络胶囊能够明显降低ApoE-/-小鼠粥样硬化斑块面积，降低血清中TNF-和IL-6含量，降低主动脉组织中Wnt1、Wnt3a、-catenin蛋白表达和基因水平。结论 通心络胶囊可降低ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠血清中炎症因子表达，降低斑块面积，其机制可能与其调控Wnt/-catenin信号通路有关。【关键词】动脉粥样硬化Wnt/-catenin通路炎症通心络胶囊ApoE-/-小鼠Effect of Tongxinluo Capsules on Inflammation in ApoE-/-Atherosclerotic Mice Based on Wnt/-cateninPathwayJiang Xuejiao，Li Jinxia，Zhang Qiuyun，Zong Wenjing.Capital Medical University，Beijing 100069，China.【Abstract】Objective：To explore the effect of Tongxinluo Capsules on the formation of atherosclerosis inApoE-/-mice and its mechanism through Wnt/-catenin signaling pathway.Methods：ApoE-/-mice were randomly divided into normal diet group and high-fat diet group.After 8 weeks of feeding，the high-fat diet groupwas randomly divided into atorvastatin group（n=6），Tongxinluo Capsules group（n=6）and model group（n=6），which were given atorvastatin 4.8 mg/（kgd），Tongxinluo Capsules ultrafine powder 1.5 g/（kgd），and the samevolume of normal saline for 8 weeks，once a day，respectively.Fasting for 12 hours after the last administration，aortic tissues were collected for hematoxylin-eosin（HE）and oil red O staining to observe the aortic plaques of micein each group；the serum of mice was collected to detect the levels of tumor necrosis factor-（TNF-）and interleukin-6（IL-6）by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The protein and gene expression levels ofWnt1，Wnt3a and-catenin in aortic tissues were detected by Western blotting and Real-time PCR.Results：Compared with the normal group，the plaque area and serum levels of inflammatory factors TNF-and IL-6 weresignificantly increased in the model group.Compared with model group，Tongxinluo Capsules group significantly reduced the area of atherosclerotic plaque and the contents of TNF-and IL-6 in serum of ApoE-/-mice.Meanwhile，the protein expression and gene level of Wnt1，Wnt3a and-catenin in aorta tissue were decreased.Conclusion：Tongxinluo Capsules can reduce the expression of inflammatory factors in serum of ApoE-/-atherosclerotic mice and reduce plaque area，and the mechanism may be related to its regulation of Wnt/-catenin signalingpathway.【Key words】Atherosclerosis；Wnt/-catenin pathway；Inflammation；Tongxinluo Capsules；ApoE-/-mice 基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（81804016，82104775）通信作者（电子邮箱：；）-43中国中医急症 2023年1月第32卷第1期JETCM.Jan.2023，Vol.32，No.1动脉粥样硬化（AS）是多种原因导致的炎症性血管疾病，其特征是在动脉壁上出现脂质堆积和纤维斑块，是多种心血管疾病发生的基础，也是目前世界上导致成人死亡的主要原因之一1-3。Wnt通路最早在肿瘤疾病中被发现，但是近年来研究显示Wnt通路在粥样硬化性心血管疾病中也有重要作用1-2，在AS的发展过程中Wnt信号通路被激活，游离的-连环蛋白（-catenin）导致炎症因子释放，进而引起血管内皮屏障破坏3、血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和细胞外基质矿化（ECM）4。通心络胶囊是依据中医络病理论而制成的中药复方，前期研究表明通心络胶囊在治疗 AS 性疾病中起到重要作用5，如降低血脂水平，改善患者微炎症状态6，减少 AS斑块面积7，改善心脏功能和血管舒张，抑制含主动脉斑块的血管生成8，可有效防治AS。然而通心络胶囊对AS的治疗作用是否与Wnt/-catenin 通路有关，目前尚不清楚。在本研究中，我们利用 ApoE-/-小鼠建立 AS 模型，观察了 Wnt/-catenin 通路的相关因子变化及通心络胶囊的干预作用。1材料与方法1.1实验动物810周龄ApoE-/-小鼠24只，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养于SPF级实验动物房，每笼2只，室温1823，湿度（50.02.0）%，每隔12 h开灯照明，自由饮食摄水。本研究严格按照国家卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行。协议得到了首都医科大学动物伦理委员会批准（批号：AEEI-2020-079），并尽一切努力减少动物的痛苦。1.2药物与试剂通心络胶囊胶囊（石家庄以岭药业股份有限公司，国药准字Z19980015），阿托伐他汀（瑞辉制药，国药准字 J20030047）。高脂饮食（含胆固醇 0.15%、脂肪21%），购自北京科奥协力饲料有限公司。生理盐水、蛋白裂解液、磷酸酶抑制剂、电泳缓冲液、电转缓冲液、脱脂专用封闭奶粉、Wnt1抗体（Proteintech，27935-1-AP）、Wnt3a 抗体（Abcam，ab219412）、-catenin 抗体（Proteintech，66379-1-Ig）、5蛋白上样缓冲液、4%多聚甲醛。1.3造模及干预8-9小鼠适应性喂养1周后随机分为正常组6只（正常饮食，8周后每日给予生理盐水1 mL/10 g），高脂饮食组18只（高脂饮食）。造模8周后随机分为模型组6只，高脂饮食，每日给予生理盐水1 mL/10 g；通心络胶囊组6只，高脂饮食，每日予通心络胶囊1.5 g/kg；阿托伐他汀组6只，高脂饮食，每日给予阿托伐他汀4.8 mg/kg。各组均持续灌胃给药8周。1.4标本制备与检查1.4.1主动脉形态学检查收集ApoE-/-小鼠主动脉根部，用4%多聚甲醛固定，样品用OCT包埋，冰冻切片4 m。然后利用苏木精和伊红（HE）、油红-O染色分析AS斑块病变。光镜下观察主动脉弓组织内膜结构及AS斑块表现，并在高倍视野下拍照。观察通心络胶囊对主动脉结构及斑块面积的影响。1.4.2蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测Wnt1、Wnt3a、-catenin蛋白表达收集各组小鼠的主动脉组织，按照蛋白定量试剂盒的说明检测蛋白浓度并定量。使用10%SDS聚丙烯凝胶电泳后，在300 mA下将蛋白转移到0.22 m PVDF膜中40 min，然后用5%脱脂奶粉密封2 h，入Wnt抗体（1 1 000）、Wnt3a抗体（1 1 000）、catenin抗体（1 1 000）孵育过夜。TBST洗涤后，二抗（1 10 000）室温孵育1 h，以GAPDH作为参考，利用化学成像分析仪进行分析，然后利用Image J进行数据分析。1.4.3酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-6、TNF-含量收集小鼠血液，4 过夜后于28 3 000 r/min离心15 min获取血清，按照试剂盒说明依次进行稀释、包被、封闭、洗涤等步骤，然后在酶标仪上，于450 nm处以空白为对照孔调零后测各孔OD值，并计算血清中IL-6、TNF-的水平。1.4.4实时荧光定量聚合物酶链式反应（RT-PCR）检测Wnt1、Wnt3a、-catenin mRNA表达使用Trizol提取小鼠主动脉中的总RNA，并使用试剂盒反转成cDNA，利用荧光染料进行扩增，扩增条件为预变性 95，10 min；热循环95，15 s，退火60，30 s，共循环40次；溶解曲线，6095，每 15 秒升温 0.3。采用2-CT法计算mRNA表达量，引物序列见表1。1.5统计学处理所有数据分析均由GraphPad软件完成。计量资料以（xs）表示。组间比较采用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.