基于斑马鱼模型汉麻仁脱脂粉降尿酸作用_董艳.pdf

食品工业 2023 年第44卷第 1 期 166 研究探讨基于斑马鱼模型汉麻仁脱脂粉降尿酸作用董艳，张正海，魏连会，宋淑敏，姬妍茹，石杰黑龙江省科学院大庆分院（大庆 163316）摘要研究以斑马鱼高尿酸模型为试验对象,探讨经超微粉碎后的汉麻仁超临界脱脂粉的辅助降尿酸作用及其可能机制。采用10 mmol/L尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾和0.5 mmol/L尿酸合成前体黄嘌呤钠盐共同处理受精后5 d(5 day post-fertilization,5 dpf)的斑马鱼20 h,建立斑马鱼高尿酸模型。以别嘌呤醇为阳性对照,对高尿酸斑马鱼分别进行500,1 000和2 000 g/mL这3种不同浓度汉麻仁脱脂粉水溶液浸泡处理,测定斑马鱼对汉麻仁脱脂粉的最大耐受浓度(maximum tolerance concentration,MTC)以及斑马鱼匀浆中的尿酸水平、次黄嘌呤鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1,HPRT1)和有机阴离子转运蛋白1(organic anion transporter 1,OAT1)的mRNA表达。汉麻仁脱脂粉对模型斑马鱼的MTC为2 000 g/mL。与模型对照组相比,汉麻仁脱脂粉可通过上调斑马鱼匀浆中HPRT1相对表达量(P0.05),有效降低尿酸水平(P0.05),而对OAT1的相对表达量无显著差异(P0.05)。汉麻仁脱脂粉具有辅助降尿酸功效,可能通过促进嘌呤的转化,抑制尿酸的产生,有望成为治疗高尿酸血症的潜在药物。关键词汉麻仁脱脂粉;斑马鱼;辅助降尿酸;基因The Uric Acid-Lowering Effect of Hemp Seed Defatted Flour Based on Zebra Fish ModelDONG Yan,ZHANG Zhenghai,WEI Lianhui,SONG Shumin,JI Yanru,SHI JieDaqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences(Daqing 163316)Abstract This study was aimed to assess uric acid-lowering effect and its possible mechanisms of supercritical hemp seed defatted flour after superfine grinding in a zebra fish model.The zebra fish high uric acid model was constructed by feeding 5 days post-fertilization zebra fish for co-treatment of uricase inhibitor potassium oxonate at 10 mmol/L and uric acid synthesis precursor xanthine sodium salt at 0.5 mmol/L for 20 h.Hemp seed defatted flour was administered to the high uric acid zebra fish through soaking at 500,1 000 and 2 000 g/ml,with allopurinol as a positive control.Maximum tolerance concentration(MTC)of hemp seed defatted flour for zebra fish,uric acid level,and mRNA expression of hypoxanthine guanine-phosphoribosyltrans-ferases transferase(HPRT1)and organic anion transporter 1(OAT1)in whole juvenile zebra fish homogenate were measured.The MTC of the hemp seed defatted flour in fish water was 2 000 g/mL in model zebra fish.Compared with control group,hemp seed defatted flour significantly reduced the level of uric acid through up-regulating HPRT1(P0.05),but OAT1 gene ex-pression was not significant(P0.05).These results demonstrated that hemp seed defatted flour hold a potential for high uric acid prevention and therapy,possibly through promoting purine conversion and inhibiting uric acid production.Keywords hemp seed defatted flour;zebra fish;auxiliary uric acid lowering;gene高尿酸血症是一种由嘌呤代谢紊乱导致血液尿酸水平异常高引起的代谢性疾病1。大约5%12%的高尿酸血症最终会发展为痛风，还与糖尿病、中风等多种疾病相关2-4。然而，目前市面上销售的治疗高尿酸血症的药物有一些副作用，限制了其临床应用。例如，别嘌呤醇的副作用包括胃肠道刺激、骨髓抑制、过敏综合征、肝炎和肾功能恶化5-6。越来越多的天然产品，如金枪鱼提取物7、乳清蛋白肽8等已被证明对高尿酸血症的控制有效且不良反应小，在高尿酸血症治疗中具有显著优势。汉麻仁含有30%以上的油脂和25%以上的蛋白9。汉麻仁蛋白中含量最高的氨基酸是谷氨酸（3.74%4.58%），其次是精氨酸（2.28%3.10%）。除赖氨酸和含硫氨基酸外，各种必需氨基酸均满足FAO/WHO对25岁婴幼儿的建议要求，是一种优质的蛋白质10-11。汉麻仁还富含被认为是潜在的抗高血压药物的肽12和具有潜在抗炎和心血管活性的木脂素酰胺13。最近的研究发现汉麻仁还可以降低肥胖Zucker大鼠血浆尿酸水平14，但其在治疗高尿酸血症的功能作用和机制尚未完全阐明。斑马鱼作为新型模式生物，与人类有高达70%以上基因同源，且有成本低、用药量少等多种优点，可以高通量地进行活性物质筛选15-16，具有成为优良高尿酸模型的潜力17。次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移 167 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 1 期酶（Hypoxanthine guanine-phosphoribosyltransferases，HPRT）是嘌呤代谢补救合成途径中的一种关键酶18。有机阴离子转运蛋白1（Organic anion transporter 1，OAT1）是SLC22A转运蛋白家族的一员，在介导肾脏尿酸盐分泌到尿液中发挥作用19。因此，本研究通过将汉麻仁脱脂粉配制成500，1 000和2 000 g/mL的3种不同质量浓度的水溶液饲养高尿酸斑马鱼幼鱼模型，分析汉麻仁脱脂粉对斑马鱼幼鱼的最大耐受浓度（Maximum tolerance concentration，MTC）及降尿酸功效和匀浆中相关基因表达水平，进而研究汉麻仁脱脂粉辅助降尿酸功效和潜在机制，为汉麻仁脱脂粉在功能食品中的应用提供理论数据20-21。1材料与方法1.1动物试验野生型AB品系斑马鱼由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，斑马鱼胚胎在光照14 h、黑暗10 h的循环水系统中以自然成对交配繁殖方式获得。斑马鱼饲养于28 的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450550 S/cm；pH为6.58.5；硬度为50100 mg/L CaCO3），试验动物使用许可证号为SCXK（浙）2022-0004。饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求。发育至受精后5天（5 days post-fertilization，5dpf）的斑马鱼用于样品辅助降尿酸功效最大耐受浓度（MTC）测定、功效评价和辅助降尿酸功效机制研究。1.2材料与试剂汉麻仁脱脂粉，为实验室经超微粉碎后采用超临界提取自制，用标准稀释水配制成10.0 mg/mL母液，现配现用；AmplexTM Red Uric Acid/Uricase Assay Kit批号2286863，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，USA；氧嗪酸钾（批号为C1808048，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China），用含0.1%羧甲基纤维素的标准稀释水配制成20 mmol/L母液，现配现用；黄嘌呤钠盐（批号为SLBV3159，Sigma，USA），用标准稀释水配制成10 mmol/L母液，现配现用；别嘌呤醇（批号为MKCM1316，Sigma，USA），用100%DMSO配成13.6 mg/mL母液，-20 保存；二甲基亚砜（DMSO，批号BCCD8942，Sigma，Switzerland）；无水乙醇（批号20210529，国药集团化学试剂有限公司，China）；iTaq Universal SYBR Green Supermix（货号1725124，Bio-rad，USA）；FastQuant RT Kit试剂盒货号KR106-02，天根生化科技（北京）有限公司，China；RNA-Quick Purification Kit（RNA快速提取试剂盒）（货号RN001，上海奕杉生物，China）。1.3仪器与设备SZX7解剖显微镜（OLYMPUS，Japan）；CP214精密电子天平（OHAUS，USA）；703001型6孔板（Nest Biotech，China）；T100普通PCR扩增仪（Bio-rad，Singapore）；CFX Connect荧光定量PCR仪（Bio-rad，Singapore）；PICO17/21高速冷冻离心机（ThermoFisher，Germany）；Nanodrop2000紫外-可见光分光光度计（Thermo，Austria）；BE-6100微孔板迷你离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，China）。1.4方法1.4.1汉麻仁脱脂粉制备流程汉麻籽脱壳CO2超临界萃取3次超微粉碎（0.150 mm）汉麻仁脱脂粉1.4.2汉麻仁脱脂粉主要成分分析方法蛋白质含量测定：GB 5009.52016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定22。脂肪含量测定：GB 5009.62016食品安全国家标准食品中脂肪的测定23。碳水化合物含量测定：GB/Z 219222008食品营养成分基本术语24。水分含量测定：GB 5009.32016食品安全国家标准食品中水分的测定25。1.4.3最大检测耐受浓度（MTC）测定将240尾5dpf正常发育的斑马鱼随机分为正常对照组、模型对照组和含五种质量浓度（125，250，500，1 000，2 000和4 000 g/mL）的汉麻仁脱脂粉的实验组于含3 mL标准稀释水（pH约为7.80.2，硬度约为250 mg/L，以CaCO3计）6孔板中，每组30尾。除正常对照组外，其余各试验组均以终浓度为0.5 mmol/L的黄嘌呤钠盐和10 mmol/L的氧嗪酸钾水溶液联合诱导斑马鱼高尿酸模型。试验组斑马鱼的标准稀释水中除含有氧嗪酸钾和黄嘌呤钠盐外，另含有不同浓度的汉麻仁脱脂粉。正常对照组不作任何药物处理。置于28 恒温培养箱中20 h后，观察各试验组斑马鱼幼鱼各靶器官的毒性及死亡情况，对各试验组斑马鱼幼鱼各靶器官无毒性且不会导致斑马鱼幼鱼死亡的样品浓度即