基于RNA干扰的杀菌剂开发及其对化学杀菌剂的影响_宋修仕.pdf

专论与综述(封面文章)doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2022.0116基于 RNA 干扰的杀菌剂开发及其对化学杀菌剂的影响宋修仕#,高静#,周明国*(南京农业大学植物保护学院，南京210995)摘 要：RNA 干扰(RNAinterference,RNAi)是真核生物中高度保守的基因沉默现象，在医药与植物保护领域展现出广阔的应用潜力，相关产品已进入或即将进入医药与杀虫剂市场。近年来，科研工作者在基于 RNAi 技术的植物病原微生物的防控方面开展了大量研究，取得了进展，但仍无法实现基于 RNAi 防治植物病原真菌技术的商业化应用。本文概述了 RNAi 研究从1990 年至今的发展历程，从细胞生物学、分子生物学角度提出了 RNAi 病害防控技术产品化瓶颈问题的新见解，同时讨论了基于 RNAi 的杀菌剂对传统化学杀菌剂的影响，可为 RNAi 杀菌剂的创制和应用提供参考。关键词:RNA 干扰；杀菌剂；植物保护；瓶颈；挑战中图分类号：Q78；TQ458.7文献标志码：ADevelopment of fungicides based on RNAi mechanism andits influence on chemical fungicidesSONGXiushi#,GAOJing#,ZHOUMingguo*(College of Plant Protectin,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210995,China)Abstract:RNAinterference(RNAi)isahighlyconservedgenesilencingphenomenonineukaryotes,whichhasshownbroadpotentialapplicationinmedicineandplantprotection.Recently,RNAi-relatedproductshavebeenorabouttobeeninthepharmaceuticalandpesticidemarkets.ForRNAi-basedfungicides,althoughresearchershavemadealotofeffortsinthedevelopmentofitsproducts,thecommercialapplicationofRNAiagainstplantpathogenshasnotarrivedonthemarketyet.Here,thedevelopmentofRNAiresearchsince1990issummarized,andnewideasthatmayhelpimprovethedevelopmentofRNAi-basedfungicidesareintroduced.Atthesametime,theinfluenceofRNAi-basedfungicidesontraditionalchemicalfungicidesisdiscussed,whichistheinnovationandapplicationofRNAifungicides.Keywords:RNAi;fungicides;plantprotection;obstacles;challenges收稿日期：2022-08-22；录用日期：2022-10-04；网络首发日期：2022-10-09.Received:August22,2022;Accepted:October4,2022;Published online:October9,2022.URL:https:/doi.org/10.16801/j.issn.1008-7303.2022.0116http:/ Journal of Pesticide ScienceE-mail: 0 引言RNA 干扰(RNAinterference，缩写为 RNAi)是指由 RNA(细胞内源或外源)诱发的基因沉默现象，其机制是短的反义 RNA 通过阻碍与其有互补序列基因的转录或翻译来抑制基因的表达。近年来，基于 RNAi 机制的有害生物防治策略发展迅速，用于防治有害生物的 RNA 分子制剂被称为核酸农药。相比于传统的小分子农药，核酸农药靶标特异性强，无残留，且开发成本远低于化学农药，符合当今社会对于环境友好型农药的要求1-2。2018 年，美国食品药品监督管理局批准了第 1 个基于 RNAi 的药物ONPATTRO，该药物可治疗伴有多发性神经疾病的遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性(hATTR)3，这标志着 RNAi 技术的应用进入一个新时代。在农业领域，首个在美国国家环境保护署(EPA)获批的核酸农药产品是表达 DvSnf7 双链 RNA 的转基因玉米，用以防治西方玉米根虫 Diabrotica virgifera virgiferaLeConte(westerncornrootworm,WCR)，该产品计划于2024 上市(https:/ 技术生产的 VT4PRO玉米也获得了 EPA的商业登记，最早将于 2024 年在美国上市。虽然RNAi 防治有害生物的技术正处于商业开发的热点阶段，但若实现其大规模应用还需要解决一些阻碍，例如 RNA 递送至靶细胞的效率问题、靶标基因的沉默效率问题、剂量限制性毒性和干扰效率不足以及 RNA 分子的稳定性和持效性等4-7。就防治病原微生物的核酸杀菌剂而言，虽然已有文章报道在实验室条件下，体外或体内应用合成的长双链 RNA(double-strandedRNA,dsRNA)或小干扰 RNA(smallinterferingRNA,siRNA)可以下调微生物中靶标必须基因的表达，从而实现防控卵菌、真菌和病毒病原体8-11，但是其防治效果与稳定性方面表现得较为复杂。本文拟从 RNAi 的发展历程中探寻那些改变核酸杀菌剂发展方向的重要事件，从理论与技术角度分析核酸杀菌剂目前存在的问题与障碍，通过比较化学杀菌剂与核酸杀菌剂的优缺点阐述核酸杀菌剂的发展对化学杀菌剂市场的影响。1 RNAi 研究的发展历程RNAi 现象是 Fire 等在对秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans 的研究中发现并揭示的12。该生物现象的发现解释了之前在植物13-14、真菌15和动物16中观察到的令人困惑的基因沉默现象。随后，RNAi 现象被证实在多种生物中广泛存在，但是不同物种间 RNAi 核心元件的起源和生物合成存在较大差异，这引发了科研人员的研究兴趣17。目前人们普遍认为 1930nt 的非编码小 RNA(smallRNAs,sRNAs)在 RNAi 过程中发挥着重要作用。sRNAs 根据来源、结构和生物作用可分为 3 类：小干扰 RNAs(siRNAs)、微小 RNAs(microRNAs，miRNAs)和 piwiRNAs(piwi-interactingRNAs,piRNAs)。大多数真菌的 sRNAs 为 siRNAs。生物体内的 RNAi 过程大致可分为起始、效应和级联放大 3 部分18。2001 年，科研工作者发现 Dicer酶是 RNAi 起始步骤的关键酶，Dicer 将长dsRNA 剪切加工为成熟的 siRNA；然后，siRNA单链被加载到具有核酸内切活性的 Argonaute 蛋白上，形成 RNA 诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。siRNA 与互补的信使 RNA(messengerRNA,mRNA)结合后，靶标 mRNA 会被 Argonaute 直接剪切或介导 RISC 对 mRNA 的翻译抑制 1。研究者随后发现，RNA 依赖性RNA 聚合酶(RNA-dependentRNAPolymerase,RdRP)参与次级小 RNA 的产生与复制，进一步增强和放大了沉默效应。在植物和秀丽隐杆线虫 C.elegans 中，RdRP 可在靶 RNA 模板上形成合成sRNA 或 dsRNA 的扩增环，起到级联放大的作用19。随着研究的逐渐深入，RNAi 成为哺乳动物20、植物21、线虫22、真菌23和卵菌24基因功能研究的重要工具。RNA 在生物体内有效的传递与运输是RNAi 应用于医药和农业领域的前提。大量研究表明，sRNA 可以在相互作用的生物体内传递(例如植物-真菌)，进而诱导彼此的基因沉默，该机制被称为跨界 RNA 干扰25-27。dsRNA 或 sRNA 只有进入细胞中才能发挥出高效的沉默效率，不同生物对 dsRNA 或 sRNA 的摄取机制存在差异。在秀丽隐杆线虫 C.elegans 中，dsRNA 的吸收主要是通过 SID 跨膜蛋白家族28-30。SID-2 基因编码一种跨膜蛋白，通过内吞作用十分缓慢地摄取 dsRNA，而 SID-1 基因产物与内吞作用无关，主要参与质膜中快速转运和通道的形成31-32。昆虫细胞摄取dsRNA 的机制现已基本确定为网格蛋白依赖性内吞作用33-35。棉铃象鼻虫 Anthonomus grandis 中2农药学学报Vol.25dsRNA 的细胞摄取与大胞饮作用相关36。到目前为止，虽然有文章报道网格蛋白介导的内吞作用参与了核盘菌对 dsRNA 的摄取37，但真菌吸收dsRNA 或 sRNA 的具体机制仍不清楚。这也限制了核酸农药在真菌防控方面的发展。RNAi 药物首先在医药领域得到发展。2003年，siRNA 首次作为药物应用于哺乳动物，其治疗潜力一度成为多家公司的研究热点38。然而，首批 siRNAs 临床试验 RNAi 效果不显著并伴随不确定的干扰效应，试验中也出现了与免疫相关的毒性，最终以失败告终；随后第 2 波的临床试验研究发现，系统应用 siRNA 纳米制剂能对人体产生效果，但是药效一般，同时表现出明显的剂量限制性毒性和疗效不足的问题39-40。鉴于 RNAi 药物的负面作用，21 世纪 10 年代初大型制药公司退出了 RNAi 药物研究领域，这对该行业造成极大的打击。但是，一些较小的 RNAi 药物公司和科研人员一直坚持改进 siRNA 的递送、序列选择、化学配方和输送机制等技术，并取得了一定的进展。2018 年，RNAi 药物 ONPATTRO(patisiran)得到美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)的批准，该类新 siRNA 药物主要用于治疗遗传性转甲状腺素淀粉样变性病41-42。最近，FDA 和 EMA 批准吉夫拉里(Givlaari)作为第 2 个 RNAi 药物用于治疗急性肝卟啉症(AHP)成人患者43-44。多种适用于肝脏、肾脏和眼部疾病的候选药物正处于 I、II 和 III 期临床试验中45-46，RNAi 医药重新成为研究焦点。基因工程(geneticengineering,GE)的迅速发展使得 RNAi 相关药品在农业领域中发展迅速4,47，核酸农药应运而生。针对有害生物的 RNAi 技术可以通过不同的方式实现，包括通过宿主诱导的基因沉默(host-inducedgenesilencing，HIGS)、喷雾诱导的基因沉默(spray-inducedgenesilencing，SIGS)以及病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，VIGS)48。农业领域首个商业化RNAi 产品是可以表达 dsRNA 的转基因玉米，通过表达靶向 Snf7 基因的发夹 dsRNA 来控制西方玉米根虫49。该商品于 2017 年获得 EPA 批准，已经以商品名 SmartStaxPro 在 2022 年上市(https:/ 5 编码基因(PSMB5)的长链 dsRNA 生物农药活性成分，名为Ledprona，目前正处在 EPA 审查注册期间(https:/www.federalregister.gov/documents/2021/06/21/2021-12999/pesticide-experimental-use-p