基于产丁酸菌组合研究参苓白...散多糖体外降解的微生态机制_林萍.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 620 基于产丁酸菌组合研究参苓白术散多糖 体外降解的微生态机制林萍1,2，邱超1，舒青龙1，封勇1（1江西中医药大学中医学院，南昌 330004；2解放军南部战区空军医院，广州 510030）摘要：目的：研究“拟杆菌/厚壁菌”与产丁酸菌组合对中药多糖体外降解机制。方法：以参苓白术散多糖为唯一碳源构建多糖培养基（PM），脑心浸液培养基（BHI）为对照，通过连续取样测定产丁酸菌在PM、及不同菌（包括脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、厚壁菌YT2等）的PM降解液中的生长曲线，评估多糖体外降解机制。结果：产丁酸菌在多形拟杆菌降解的PM降解液中生长最好，在PM中的生长最差；PM/BHI分别经多糖降解菌降解后，PM中的产丁酸菌菌群数量更高；丁酸浓度变化中，经厚壁菌YT2的PM降解液最高，PM中产丁酸浓度最低；经多糖降解菌降解的PM降解液经多糖降解菌降解的BHI降解液。结论：“拟杆菌/厚壁菌”产丁酸菌组合有利于对中药多糖的降解利用和丁酸生产。关键词：产丁酸菌；参苓白术散；多糖；碳源；多糖降解菌基金资助：国家自然科学基金项目（No.82160788）Study on the microecological mechanism of polysaccharide degradation of Shenling Baizhu Powder in vitro based on butyric acid producing bacteria combinationLIN Ping1,2,QIU Chao1,SHU Qing-long1,FENG Yong1(1College of Traditional Chinese Medicine,Jiangxi University of Chinese Medicine,Nanchang 330004,China;2Air Force Hospital of Southern Theater Command of PLA,Guangzhou 510030,China)Abstract:Objective:To study the degradation mechanism of traditional Chinese medicine polysaccharides in vitro by the combination of Bacteroides/firmicum and butyric acid producing bacteria.Polysaccharide medium(PM)was constructed with the polysaccharide of Shenling Baizhu Powder as the only carbon source,and brain heart infusion broth(BHI)was used as the control.Through continuous sampling,the growth curve of butyric acid producing bacteria in PM and PM degradation solution of different bacteria(including Bacteroides fragilis,Bacteroides thetaiotaomicron and Clostridium sp.YT2,etc.)was determined were measured to evaluate the degradation mechanism of polysaccharides in vitro.Results:Butyric acid producing bacteria grew best in PM degradation solution degraded by Bacteroides thetaiotaomicron and worst in PM.After PM/BHI was degraded by polysaccharide degrading bacteria,the number of butyric acid producing bacteria in PM was higher;Among the changes of butyric acid concentration,the PM degradation solution treated by thick walled Clostridium sp.YT2 was the highest,and the butyric acid concentration produced by PM was the lowest.PM degradation solution degraded by polysaccharide degrading bacteria BHI degradation solution degraded by polysaccharide degrading bacteria.Conclusion:Bacteroides/firmicum combination of butyric acid producing bacteria is conducive to the degradation and utilization of traditional Chinese medicine polysaccharides and butyric acid production.Key words:Butyric acid producing bacteria;Shenling Baizhu Powder;Polysaccharide;Carbon source;Polysaccharide degrading bacteriaFunding:National Natural Science Foundation of China(No.82160788)论著通信作者：舒青龙，江西省南昌市新建区梅岭大道1688号江西中医药大学中医学院，邮编：330004，电话：0791-87118921E-mail：健康人结肠主要由厚壁菌和拟杆菌两个细菌门组成，占肠道微生物总数的90%1。产丁酸菌作为其中一类系统发育多样、数量丰富的细菌，分布在结肠厚壁菌门，主要代谢产物是在维持肠道健康方面发挥重要作用的底物丁酸2-4。产丁酸菌可以利用多种多糖，对膳食成分的结肠发酵有重要贡献3。但是主要内文1.indd 6202023/2/10 16:57:36中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 621 结肠厚壁菌门缺乏直接将碳水化合物代谢形成丁酸的能力4。一般来说，多糖越复杂其分解所需的酶就越多，拟杆菌具有编码多糖利用位点（polysaccharide utilization locus，PULs）的基因簇，使多糖片段的大部分水解发生在拟杆菌属的周质空间中，与厚壁菌相比，拟杆菌携带多糖降解相关的基因更多5-6。参苓白术散出自 太平惠民和剂局方，具有补脾气、祛湿气、行气机、恢复脾胃纳运功能的作用，是临床治疗腹泻的常用方7。参苓白术散中包含多种有效活性成分，多糖是其中一种，中药活性成分的分解代谢也被认为与肠道菌群密切相关8-9。多糖作为中药中的主要成分之一，主要通过减缓胃排空，调节肠道菌群结构，作为微生物发酵基质和保护免疫系统有益于我们的健康10。大多数多糖不能被消化系统完全消化，其有益效果主要取决于其发酵性以及生理化学性质，因此，多糖与多糖降解菌的联系影响宿主的健康，不同种类多糖和含量对细菌种群有不同的影响11。肠道菌群将多糖作为最终代谢产物降解为短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），改变肠道菌群生态，在维持上皮屏障功能、调节免疫应答等方面发挥重要作用12。但“中药多糖降解为SCFAs过程中核心功能菌群的协同机制”尚不明确，具体包括中药多糖如何降解为单糖，单糖后续又如何降解为SCFAs。近年来研究发现，多糖降解为单糖主要由含PULs的拟杆菌或是含革兰氏阳性多糖利用位点（gram-positive PULs，gpPULs）的厚壁菌进行降解13-14，而单糖后续降解为丁酸则是由产丁酸菌参与15-16。因此，为验证以上两种菌在中药多糖降解为丁酸的协同性，本研究通过产丁酸菌组合不同多糖降解菌的方法研究参苓白术散多糖的降解机制，旨在为“中药多糖降解为丁酸过程中核心功能菌群的协同机制”科学问题的解决提供研究基础。材料1.药材 参苓白术散（桔梗、莲子、砂仁、薏苡仁、白扁豆、茯苓、党参、炙甘草、白术、山药，质量比为50 50 50 5075 100 100 100 100 100），各饮片购于江西中医药大学附属医院。由江西中医药大学中医学院科研实验中心董德刚副教授鉴定为正品。2.菌株 丁酸梭菌（广东省微生物菌种保藏中心，Clostridium butyricum ATCC19398），厚壁菌YT2（分离株，环境为土壤，Clostridium sp.YT2），多形拟杆菌（美国模式培养物集存库，Bacteroides thetaiotaomicron ATCC29148），脆弱拟杆菌（美国模式培养物集存库，Bacteroides fragile ATCC25285）。3.试剂 脑心浸液培养基（brain heart infusion broth，BHI）（Oxoid公司，批号：CM1135）；L-半胱氨酸（批号：MC1020B10010J）、氯化镁（批号：ZL0415S5011Z）、磷酸二氢钾（批号：MC0228B5011M）、氯化钙（批号：MC0426S01112）、氯化钠（批号：ZL04251310011Z）、硫酸亚铁（批号：ZL0119B5011L）、硫酸铵（批号：ZL0224B5011L）、L-组氨酸均为生物工程（上海）有限公司生产。血红素（批号：517B021）、维生素K3（批号：502E021）、维生素B12（批号：615H031）均为Solarbio公司生产；细菌DNA提取试剂盒（北京天根，批号：Q6204），正丁酸对照品（美国Aladdin公司，批号：E1818012）。4.仪器 SQP万分之一电子天平秤（北京赛多利斯），Mark厌氧工作站（荷兰Mark公司），SW-CJ-2D超净工作台（苏州净化设备有限公司），SPX-150B-Z生化培养箱（上海光都仪器设备有限公司），BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器（上海搏迅实业有限公司医疗设备厂），WFJ 7200型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司，H1650型高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），SHZ-D循环水真空泵（巩义市予华仪器有限公司），pH400 pH计（上海安莱立思仪器科技有限公司），Zebron ZB-WAXplus色谱柱（天津博纳艾杰尔科技有限公司），GC2010型气相色谱仪岛津企业管理（中国）有限公司。方法1.参苓白术散多糖的提取及含量测定 通过水提醇沉法提取参苓白术散多糖，随后用Sevage试剂去除蛋白，大孔弱碱性树脂去除色素，透析膜透析去除小分子纯化参苓白术散多糖，得到的多糖用苯酚硫酸比色法测定含量17。2.菌株鉴定 分别对丁酸梭菌、多形拟杆菌、脆弱拟杆菌、厚壁菌YT2进行DNA提取，使用16S rRNA基因引物27F（5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3）、1492R（5-GGT TAC CTT GTT ACG ACT-3）分别对4种细菌DNA进行PCR扩增，产物长度约为1 500 bp。扩增产物纯化后送上海生工公司进行Sanger双端测序，所得序列在NCBI数据库进