基于TLR4_NF-κB_...D大鼠神经炎症的作用及机制_黄丽萍.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 江西省主要学科学术和技术带头人项目（）；江西省自然科学基金项目（）；江西省重点研发计划项目（，）；江西省中医药管理局课题（）；江西中医药大学校级科技创新团队发展计划项目（）通信作者陈耀辉，硕士，副主任医师，主要从事肾病临床与实验研究，：作者简介 黄丽萍，博士，教授，主要从事中药神经药理研究，：基于 通路探讨二精丸减轻 大鼠神经炎症的作用及机制黄丽萍，卢龙辉，杨喜洋，谢永艳，徐子薇，朱徐东，王晶晶，吴志鑫，唐健富，吴毅，陈耀辉（江西中医药大学 药学院，江西 南昌；江西省人民医院，江西 南昌；莆田市第一医院，福建 莆田；国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室江西省药品与医疗器械质量工程研究中心 江西省药品检验检测研究院，江西 南昌；江西省中药药理重点实验室，江西 南昌）摘要 研究二精丸对 半乳糖联合 淀粉样蛋白（）致阿尔茨海默病（）大鼠神经炎症的改善作用及可能机制。大鼠随机分为假手术组、模型对照组、阳性药物组（多奈哌齐，）、二精丸高剂量组（）、二精丸低剂量组（.），每组 只。半乳糖腹腔注射 周后，连续灌胃给药 周；半乳糖腹腔注射 周后，大鼠双侧海马注射。灌胃给药 周后，新物体识别实验检测大鼠学习记忆能力。末次给药 后，取组织，免疫荧光法检测大鼠脑组织小胶质细胞活化情况；免疫组化检测大鼠海马 区 和磷酸化 蛋白（，）阳性表达；酶联免疫吸附（，）法检测大鼠脑组织炎症因子白细胞介素（，）、肿瘤坏死因子（，）、白细胞介素（）水平；法检测大鼠脑组织 样受体（，）核因子（，）核苷酸结合寡聚化结构域样受体（，）通路相关蛋白表达。结果显示，与假手术组比较，模型对照组大鼠新物体识别指数明显下降，海马区 沉积和 阳性蛋白显著增多，脑组织齿状回处小胶质细胞活化水平显著增高，海马组织、水平明显升高；海马、蛋白表达水平显著升高。与模型对照组比较，二精丸可提高大鼠新物体识别指数，减少海马区 沉积和 阳性蛋白表达，抑制脑组织齿状回小胶质细胞活化；降低海马组织、炎症因子水平；下调、蛋白的表达。综上所述，二精丸可能通过改善小胶质细胞活化，降低神经炎症因子、表达水平，抑制 神经炎症通路，减少海马 沉积和 表达，恢复海马形态结构，改善 模型大鼠的学习记忆能力。关键词 二精丸；神经炎症；阿尔茨海默病；通路；小胶质细胞 ，（，；，；，；黄丽萍等：基于 通路探讨二精丸减轻 大鼠神经炎症的作用及机制 ，；，）（），（，），（.），（.），（）（），（），（）（）（）（）（），；：.阿尔茨海默病（，）是痴呆的最常见形式，以进行性记忆和认知功能障碍为主要表现，其特征性病理变化表现为皮层与海马胆碱能神经元缺失、神经细胞外 淀粉样肽（，）聚集形成老年斑（，）、细胞内高度磷酸化（）蛋白形成神经原纤维缠结（，）以及神经炎症。其中，神经炎症和 之间相互交织的病理学被认为对 的发展至关重要。随着老龄化程度的加重，的发病率逐年上升。年约有 患者 万人，到 年，患者的数量预计将达到近.亿人。严重威胁老年人的生命安全，是继心脏病、癌症后的第 位死因，世界卫生组织已将其列为全球公共卫生重点。现有的药物如乙酰胆碱酯酶（）抑制剂、甲基天冬氨酸（）受体拮抗剂等在一定程度上能缓解 症状，但疗效不理想。流行病学证据表明，非甾体抗炎药（）在一定程度上能够减轻神经炎症反应，延缓 进展，提示抑制神经炎症可能是治疗 的未来策略。但胃肠道并发症的高发生率限制了 在 一级治疗中的长期临床应用。因此，寻找有效药物以延缓、控制 的发生和发展，是目前社会迫切的需求。中医学认为“肾主智，肾虚则智不足”。二精丸记载于圣济总录，由黄精、枸杞子 味中药组成，具有滋肾益智作用。现代药理研究发现，二精丸对于多种原因所致的 动物模型有效，可显著改善学习记忆和病理形态。但二精丸能否通过改善 年 月第 卷第 期.，.，神经炎症从而起到防治 的作用目前尚不清楚，值得进一步深入探讨。本研究在采用前期已建立的半乳糖所致 大鼠模型，观察二精丸对其海马小胶质细胞活化、炎症相关因子，以及神经炎症的经典通路 相关蛋白表达的影响，探究二精丸是否能通过抑制神经炎症达到防治 作用，为二精丸临床防治 提供科学依据。材料.药材黄精 ，枸杞子 购于樟树市正一中药材有限公司，由江西省药品检验检测研究院吴毅主任药师鉴定均为正品。.动物 只 级 雄性大鼠，体质量（），购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号（湘）。本实验获得江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（动物伦理委员会编号）。.试剂 半乳糖（公司，批号）；（公司，批号）；盐酸多奈 哌 齐 片（卫 材 中 国 药 业 有 限 公 司，批 号）；组织细胞固定液（公司，批号）；白细胞介素（，）、白细胞介素（，）、肿瘤坏死因子（，）的酶联免疫吸附法（，）试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批号分别为、）；蛋白定量试剂盒（上 海 碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司，批 号）；核苷酸结合寡聚化结构域样受体（，）、样受体（，）、磷 酸 化 蛋 白（，）（公 司，批 号 分 别 为、）；、凋亡相关斑点样蛋白（，）（公司，批号分别为、）；溶 液（公 司，批 号）；山羊抗兔免疫球蛋白（公司，批号）；核因子 （，）、内参抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（公司，批号分别为、）；兔抗炎性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（，）、兔抗核转录因子 抑制因子（公司，批号分别为、）。.仪器 新物体识别系统诺达思（北京）信息技术有限责任公司；万分之一分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；蓝星 脑立体定位仪、柔性颅骨钻（安徽正华生物仪器设备有限公司）；微量注射泵（公司）；高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；电泳仪、制胶设备（公司）；共聚焦显微镜、倒置荧光显微镜（公司）；型吸收光酶标仪（公司）；化学发光成像仪（公司）。方法.药物制备参考文献方法制备。黄精、枸杞各取 ，加 倍体积自来水浸泡 后，煮沸，煎煮 次第 次煎煮 ，第 次煎煮，次煎煮液滤过后合并，减压浓缩得药液含生药量.，冰箱保存备用。.动物造模、分组及给药参考文献进行。大鼠在常规环境中适应性喂养 周，随机分为假手术组、模型对照组（半乳糖 侧）、阳性药物组（多奈哌齐组，）、二精丸高剂量组（）、二精丸低剂量组（.），每组 只。除假手术组外，其余各组腹腔注射 半乳糖 ，每日 次，持续 周。半乳糖注射 周后，开始灌胃给药，每日 次，给药容量为 ，连续给药 周。半乳糖注射 周后，双侧海马注射 侧。.新物体识别实验检测学习记忆能力 参考文献进行。将大鼠放入敞箱，让其自由活动 ，适应环境。在敞箱对角线中心放置物体、，保持其余因素不变，记录大鼠对物体、各自的探索时间，分别记录为 和。第 天，将物体 更换为物体，记录新物体 的学习时间为，旧物体 的学习时间为。新物体识别指数 （），通过该指标可反映出大鼠的学习记忆能力。.取材及处理 末次给药 后，参考文献方法麻醉大鼠，心脏灌流后取脑，左右半脑分离，左半脑固定于 多聚甲醛溶液，右半脑分离皮层与黄丽萍等：基于 通路探讨二精丸减轻 大鼠神经炎症的作用及机制海马，放于 冰箱保存备用。.大鼠脑组织小胶质细胞活化的检测参考文献进行。每组取 个大脑组织，冰冻切片，切片厚度为 ，按下法进行免疫荧光染色。冰冻切片复温 ；冲洗 次，滤纸吸干，免疫组化笔画圈；配置好的封闭液封闭 （一个组织），常温（放入湿盒，湿盒底部加水）；甩去封闭液，不用 冲洗，滤纸吸干；用封闭液配置一抗小胶 质 细 胞 离 子 钙 接 头 蛋 白 分 子（），兔来源，孵一抗，冰箱过夜（）；甩去一抗，冲洗 次，滤纸吸干；用封闭液配制二抗（山羊抗兔，），孵二抗，常温，避光 ；甩去二抗，冲洗 ，滤纸吸干；染细胞核，；甩去，冲洗，滤纸吸干；抗荧光衰减封片剂封片。冰箱避光保存，共聚焦显微镜拍照。.二精丸对 大鼠海马区、蛋白表达水平的影响参考文献进行。海马组织进行石蜡切片，将待测切片放于 烘箱烤片，按说明书步骤进行免疫组化实验。其中一抗孵育方式及用量：每片滴加 （），或（），放于暗盒中 过夜（）。.大鼠海马组织神经炎症因子、水平测定取一定量的组织进行匀浆后，按 试剂盒说明书，测定大鼠海马组织、水平。.大鼠海马 通路相关蛋白检测提取海马组织总蛋白，法测定蛋白浓度，加入适量 ，沸水浴 备用。每孔加入等量蛋白样品进行 电泳，转移至 膜上，脱脂奶粉（或）室温封闭 漂洗后加入、及 抗体，孵育过夜用 充分漂洗后加入 标记的二抗。于低温摇床上常温孵育 。再用 洗膜 次，每次 ，化学发光法显色曝光。.统计学分析 标准曲线回归方程使用 进行计算，拟合模型选用 曲线（四参数）。用 软件对 图片进行分析；数据采用 .软件处理，多组间样本差异采用单因素方差分析（）方法分析，计量资料用均值标准差（?）表示，以.为差异有统计学意义。结果.二精丸对 大鼠学习记忆能力的影响熟悉期大鼠对于相同物体的探索时间没有明显区别，说明大鼠对 个物体不存在偏好选择。模型对照组大鼠较假手术组大鼠的识别指数明显下降，提示其记忆能力下降；二精丸高剂量组大鼠识别指数显著性增高，提示二精丸高剂量可明显改善 大鼠学习记忆能力，见图。假手术组、模型对照组、阳性药物组、二精丸高剂量组、二精丸低剂量组样本量分别为、（图、，表、同）。与假手术组比较.，.；与模型对照组比较.，.（图、同）。图 二精丸对 半乳糖联合 所致 大鼠学习记忆能力的影响（?）（?）.二精丸对 大鼠海马区 和 表达水平的影响 与假手术组比较，模型对照组大鼠海马 区细胞减少，周围着色较深，表达显著增多，区胞浆和突起着色较深，蛋白表达水平显著升高；与模型对照组比较，二精丸高、低剂量组大鼠海马 区细胞增多，着色较浅，表达显著减少；二精丸高剂量组大鼠海马 区细胞着色较浅，阳性表达细胞显著降低，提示二精丸可明显改善 大鼠病理变化，见图、表。.二精丸对 模型大鼠脑组织小胶质细胞活化水平的影响假手术组大鼠齿状回区荧光强度弱，小胶质细胞均匀分布于脑组织，胞体小而圆，突起呈现“树枝状”，提示大多处于 型；与假手术比 年 月第 卷第 期.，.，图 二精丸对 大鼠海马区、表达水平的影响（免疫组化，；?）（，；?）表 二精丸对 大鼠海马区、表达水平的影响（?）（?）组别剂量阳性表达强度假手术.模型对照.）.）阳性药物 .）.）二精丸 .）.）.）.注：与假手术组比较）.；与模型对照组比较）.（表 同）。较，模型对照组大鼠脑组织齿状回处小胶质细胞“树枝状”突起消失，形态呈“阿米巴虫状”，荧光强度信号变强且密集，说明小胶质细胞转变为活化状态，且活化水平显著升高；与模型对照组比较二精丸组大鼠脑组织齿状回处小胶质细胞“阿米巴虫状”形态减少，呈现较多“树枝状”突起，且荧光强度信号减弱，表示小胶质细胞活化程度显著降低，见图、表。.二精丸对 大鼠海马组织、水平的影响与假手术组相比，模型对照组大 图 二精丸对 模型大鼠脑组织小胶质细胞活化水平的影响（免疫荧光，）（，）鼠海马组织中、含量均明显升高，差异具有统计学意义；与模型对照组相比，二精丸高剂量组大鼠海马组织中、含量明显降低，见图。黄丽萍等：基于 通路探讨二精丸减轻 大鼠神经炎症的作用及机制表 二精丸对 模型大鼠脑组织小胶质细胞平均荧光强度的影响（?）（?）组别剂量平均荧光强度假手术.模型对照.）阳性药物 .）二精丸 .）.）.二精丸对 大鼠海马 通路相关蛋白表达的影响与假手术组比较，模型对照组大鼠海马、炎性小体 水平明显升高；与模型对照组相比，二精丸高剂量组大鼠海马、炎性小体 水平明显下降，见图。讨论目前临床对于 的干预，以对症治疗、延缓进 图 二精丸对 大鼠海马组织、水平的影响（?），（?）图 二精丸对 大鼠海马 通路相关蛋白表达的影响（?，）（?，）年 月第 卷第 期.，.，程为主，尚无治愈或逆转疾病的药物或方法。越来越多的证据表明，大脑持续慢性神经炎症反应（）是 的另一个核心特征。大量的动物实验和临床研究证实，神经炎症贯穿于 发生的始终，神经炎症不但是 病理的重要组成部分，并可能是其他病理特征形成和发展的诱发