基于PI3K_AKT信号通...大鼠增殖凋亡相关蛋白的影响_邓省.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 795 基于PI3K/AKT信号通路探讨菟丝子-枸杞子对 少弱精子症大鼠增殖凋亡相关蛋白的影响邓省1,2，李海松2，王彬2，鲍丙豪3，冯隽龙2，孟繁超2，王世桢2，徐洪胜2，王继升2（1北京中医医院顺义医院，北京 101300；2北京中医药大学东直门医院，北京 100700；3中日友好医院，北京 100029）摘要：目的：探讨菟丝子-枸杞子（SC-FL）改善雷公藤多苷（GTW）诱导的少弱精子症模型的机制。方法：将40只雄性SD大鼠随机分为空白组（NC组）、模型组（GTW组）、模型+左卡尼汀处理组（GTW+LEV组）和模型+SC-FL处理组（GTW+SC-FL组），每组10只。予GTW 40 mgkg-1d-1 4周构建生精障碍模型。成模后GTW+LEV组予左卡尼汀（LEV）混悬液0.2 gkg-1d-1，GTW+SC-FL组予SC-FL混悬液0.45 gkg-1d-1，连续 4周。检测各组大鼠精子质量、睾丸组织学变化以及相关蛋白质和mRNA表达。结果：GTW+SC-FL组和GTW+LEV组大鼠精子浓度及前向运动级+非前向运动级精子比率显著高于GTW组（P0.01），且GTW+SC-FL组精子浓度显著高于GTW+LEV组（P0.01）。苏木精-伊红染色结果显示，相较于GTW组，治疗后大鼠睾丸组织中精曲小管等结构得到一定恢复。GTW+SC-FL组磷脂酰肌醇-3激酶、AKT丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白和mRNA表达较GTW组及GTW+LEV组显著上调（P0.01，P0.05）。结论：菟丝子-枸杞子药对能够有效减轻GTW造成的生精功能障碍，其机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。关键词：菟丝子；枸杞子；药对；雷公藤多苷；少弱精子症；体内实验；PI3K/AKT信号通路基金资助：北京市科学技术协会青年人才托举工程（No.BYESS2022182），中华中医药学会青年人才托举工程项目（No.2021-QNRC2-B04），国家自然科学基金面上项目（No.81774320）Effects of Cuscuta chinensis Lam.and Lycium barbarum L.on proliferation and apoptosis-related proteins in oligoasthenospermia rats based on PI3K/AKT signaling pathwayDENG Sheng1,2,LI Hai-song2,WANG Bin2,BAO Bing-hao3,FENG Jun-long2,MENG Fan-chao2,WANG Shi-zhen2,XU Hong-sheng2,WANG Ji-sheng2(1Shunyi Hospital,Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Beijing 101300,China;2Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China;3China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China)Abstract:Objective:To investigate the mechanism of Cuscuta chinensis Lam.and Lycium barbarum L.(SC-FL)improving Tripterygium wilfordii polyglycosides(GTW)-induced oligoasthenospermia model.Methods:Forty male SD rats were randomly divided into blank group(NC group),model group(GTW group),model+L-carnitine treatment group(GTW+LEV group)and model+SC-FL treatment group(GTW+SC-FL group),10 rats in each group.The model of spermatogenesis disorder was established by giving GTW 40 mgkg-1d-1 for 4 weeks.After modeling,the GTW+LEV group was given L-carnitine(LEV)suspension 0.2 gkg-1d-1,and the GTW+SC-FL group was given SC-FL suspension 0.45 gkg-1d-1 for 4 consecutive weeks.The sperm quality,testis histological changes and related protein and mRNA expressions were detected in each group.研究报告通信作者：王继升，北京市东城区海运仓5号北京中医药大学东直门医院，邮编：100700，电话：010-84013276E-mail：内文2.indd 7952023/2/28 10:35:54中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 796 Results:The sperm concentration and the ratio of forward motility grade+non-forward motility grade sperm in GTW+SC-FL group and GTW+LEV group were significantly higher than those in GTW group(P0.01).And the sperm concentration in GTW+SC-FL group increased more significantly than GPW+LEV group(P0.01).The results of hematoxylin-eosin staining showed that compared with the GTW group,the structures such as seminiferous tubules in the testis tissue of the rats were restored to a certain extent after treatment.The protein and mRNA expressions of Phosphatidylinositol-3 kinase(PI3K),AKT Serine/Threonine-protein kinase(AKT)and B-cell lymphoma/leukemia-2(Bcl-2)were up-regulated compared with GTW group and GTW+SC-FL group(P0.01,P0.05).Conclusion:SC-FL can effectively alleviate the spermatogenic dysfunction caused by GTW,and its mechanism may be related to the PI3K/AKT signaling pathway.Key words:Cuscuta chinensis Lam.;Lycium barbarum L.;Medicinal couplet;Tripterygium wilfordii polyglycosides;Oligoasthenospermia;In vivo experiments;PI3K/AKT signaling pathwayFunding:Young Elite Scientists Sponsorship Program by Beijing Association of Science and Technology (No.BYESS2022182),Young Elite Scientists Sponsorship Program by CACM(No.2021-QNRC2-B04),National Natural Science Foundation of China(No.81774320)少精子症指精子浓度15106/mL，弱精子症指前向运动级+非前向运动级精子比率（percentage of forward motile sperm+non-forward motile sperm，PR+NP）40%，二者往往合并出现1。据统计，40%75%的男性不育因素来自少弱精子症2。西医多采用激素药物或针对病因，在临床上存在一定局限性3。研究4-5表明，PI3K/AKT信号通路是精子发生、成熟的重要调控环节，可能存在相关的治疗靶点。近年来，中医药在男性不育症中的治疗作用逐渐得到确认6，补肾生精是中医治疗的核心思想7。菟丝子-枸杞子具有补肾生精的功效，临床上应用广泛，疗效显著8，并且为诸多治疗男性不育症经典方剂的核心 药对9。因此，本研究旨在通过观察菟丝子-枸杞子对雷公藤多苷诱导的少弱精子症大鼠的改善情况，检测PI3K/AKT信号通路中增殖凋亡相关蛋白及mRNA的变化，进而分析其可能的作用机制。材料与方法1.动物 SPF级SD雄性大鼠40只，6周龄，体质量（20020）g，购自Charles River公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养于北京中医药大学东直门医院SPF级动物室内，每天光照1012 h，室内湿度为55%60%，温度为2226，予去离子水和固体饲料适应7 d。该研究由北京中医药大学东直门医院实验动物伦理委员会审查和批准（伦理批号：19-27）。2.药物与试剂 雷公藤多苷片（批号：130801，规格：10 mg/片，新陇海药业有限公司），充分研磨，使其成粉状无大颗粒，以去离子水将其充分溶解为4 mg/mL。左卡尼汀（L-carnitine，LEV）口服液（批号：130801，新陇海药业有限公司）。菟丝子、枸杞子（批号：19002221-19002881，北京康仁堂公司），免煎颗粒剂（每剂药包含菟丝子15 g；枸杞子15 g。1 g枸杞子颗粒相当于5 g中药饮片，1 g菟丝子颗粒相当于10 g中药饮片）；将菟丝子和枸杞子颗粒按照2 1的比例配成混合，温水溶解后低温保存备用（每毫升含颗粒剂45 mg）。戊巴比妥钠（批号：820601，国药），PBS缓冲液（批号：A7030，北京吉普生物技术有限公司），EDTA抗原修复液（批号：J0175，北京吉普生物技术有限公司）。磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）抗体（批号：ab191606，Abcam），磷酸化AKT丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（phosphorylation-AKT serine/threonine-protein kinase，p-AKT）抗体（批号：bs-2720R，Bioss），B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）抗体（批号：sc-492，Santa）。3.模型制备 40只大鼠称重并随机分为空白组（NC组）、模型组（GTW组）、模型+左卡尼汀处理组（GTW+LEV组）和模型+SC-FL处理组（GTW+SC-FL组），每组10只。GTW、GTW+LEV和GTW+SC