基于NF-κB信号通路探讨...骨性关节炎滑膜炎症效果机制_任立桐.pdf

第21卷第6期总第398期2 0 2 3年3月下 半 月 刊中国中医药现代远程教育CHINESE MEDICINE MODERN DISTANCE EDUCATION OF CHINA基于 NF-B 信号通路探讨牛膝总皂苷治疗膝骨性关节炎滑膜炎症效果机制*任立桐1姚志城2喻晓龙21.北京中医药大学深圳医院（龙岗）急诊科，广东 深圳 518172；2.北京中医药大学深圳医院（龙岗）骨伤科，广东 深圳 518172摘要：目的基于 NF-B 信号通路探讨牛膝总皂苷治疗膝骨性关节炎滑膜炎症的机制。方法选择 SPF 级 SD 大鼠 60只，随机分成对比组、模型组、牛膝总皂苷低剂量组、牛膝总皂苷中剂量组、牛膝总皂苷高剂量组，每组 12 只。除对比组外，其他各组大鼠在关节两侧进针，从第 1 天开始每间隔 2 d 分别注射 0.3 mL 5%木瓜蛋白酶水溶液到大鼠膝关节腔内，比较 5 组大鼠关节炎症指标。结果与对比组比较，模型组的膝关节肿胀程度较严重，miR-19的基因表达水平较低，而 SOX9、NF-B的基因水平表达较高，使用牛膝总皂苷的 3 组，根据剂量的增加肿胀水平依次降低，miR-19基因表达水平依次增高，而SOX9 以及 NF-B 的基因表达水平和蛋白表达水平依次降低。结论牛膝总皂苷能减轻骨关节炎的炎症症状，并且能通过上调 miR-19的表达抑制 SOX9、NF-B 的表达水平，保护软骨细胞的凋亡。关键词：牛膝总皂苷；NF-B 信号通路；关节炎；大鼠；实验研究doi:10.3969/j.issn.1672-2779.2023.06.058文章编号：1672-2779（2023）-06-0164-03Discussion on the Mechanism of Total Saponins of Achyranthes Bidentalis in the Treatment ofSynovial Inflammation of Knee Osteoarthritis Based on NF-B Signaling PathwayREN Litong1,YAO Zhicheng2,YU Xiaolong2(1.Emergency Department,Shenzhen Hospital(Longgang),Beijing University of Chinese Medicine,Guangdong Province,Shenzhen 518172,China;2.Department of Orthopedics,Shenzhen Hospital(Longgang),Beijing University of Chinese Medicine,Guangdong Province,Shenzhen 518172,China)Abstract：Objective Based on the NF-B signaling pathway to explore the therapeutic mechanism of total saponins of achyranthesbidentata in the treatment of synovial inflammation of knee osteoarthritis.Methods Sixty SPF SD rats were selected and randomly divided into control group,model group,low-dose achyranthes bidentata saponin group,achyranthes bidentata mid-dose group,achyranthes bidentata saponin high-dose group,with 12 rats in each group.Except for the control group,the rats in the other groupswere injected with needles on both sides of the joints.From the first day,0.3mL of 5%papain aqueous solution was injected everytwo days into the knee joint cavity of the rats.The ratsjoint inflammation indexes of five groups was compared.Results Comparedwith the control group,the knee joint swelling of the model group was more serious,the gene expression level of miR-19 was lower,and the gene expression level of SOX9 and NF-B was higher.The three groups using total saponin of achyranthes bidentata,according to the dose the level of swelling decreased successively,the expression level of miR-19 gene increased successively,while thegene expression level and protein expression level of SOX9 and NF-B successively decreased.Conclusion Achyranthes bidentatasaponins can alleviate the inflammatory symptoms of osteoarthritis,and can pass up-regulating the expression of miR-19 inhibits theexpression levels of SOX9 and NF-B,and protects chondrocytes from apoptosis.Keywords：achyranthes bidentata total saponins;NF-B signaling pathway;chondrocytes;arthritis;rat;experimental study*基金项目：深圳市龙岗区经济与科技发展专项资金医疗卫生科技计划项目【No.LGKCYLWS2020067】骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种由许多因素造成的关节退行疾病1，常见于老年人。随着老龄化的逐渐加深，以及肥胖人群的增加，患骨关节炎的患者有明显上升趋势。骨关节炎的主要特征表现在软骨上2，关节炎让软骨退化，引起软骨下骨的变化，以及造成骨赘形成、滑膜炎症和骨关节炎，并逐步损坏关节软骨，让患者的关节功能受限，肌肉僵硬。虽然当前仍然没有明确引发骨关节炎的发病因素，但是有报道显示，骨关节炎的发病因素被年龄、性别、肥胖等影响。研究3显示，目前已确认 NF-B 转录因子在骨关节炎中表达非常活跃，也是导致骨关节炎的疾病因164第21卷第6期总第398期2 0 2 3年3月下 半 月 刊中国中医药现代远程教育CHINESE MEDICINE MODERN DISTANCE EDUCATION OF CHINA子。NF-B 在骨关节炎的许多发病环节都有体现，比如软骨细胞分解代谢、软骨细胞存活和滑膜炎症。另有研究4，5表明，在骨关节炎软骨中 SOX9 的基因表达水平降低4，并且 SOX9 的蛋白表达水平也有降低，而miR-19a 作为一种新的生物标志物，具有非入侵、敏感以及可靠的特性，多用来诊断和评估多种恶性肿瘤以及其他炎症性疾病。还有研究6发现，牛膝总皂苷对关节软骨具有保护作用，同时能达到保护软骨细胞的目的。因此，本研究旨在基于 NF-B 信号通路探讨牛膝总皂苷治疗膝骨性关节炎滑膜炎症的效果机制，现作报告如下。1资料与方法1.1一般资料1.1.1动物选择 SPF 级 SD 大鼠 60 只，雌雄各半，10 周龄，体质量（26010）g，购自厦门大学实验动物中心，动物合格证号：scxK（闽）2021012。将大鼠分笼饲养，按照需求饮食，调节室内温度至适宜。本动物研究实验已经过批准。1.1.2药物牛膝总皂苷（Total saponins of achyran-thes，TSA，（陕西森弗生物技术有限公司），含量70.2%；TRIzol 试剂、PrimeScriptTMRT 试剂盒（美国Sigma 公司）；SYBR Premix Ex Taq 实时荧光定量试剂盒（日本 Takara 公司）；SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒（美国 BD公司）；蛋白酶抑制剂、BCA蛋白质试剂盒、蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀测定缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）；PVDF 膜（美国 PeproTech 公司）；SOX9、NF-B 一抗、单克隆 GAPDH 抗体、荧光染料标记的二抗（武汉博士德生物有限公司）；引物由上海羽朵生物科技有限公司合成。1.2方法大鼠随机分成 5 组：对比组、模型组、牛膝总皂苷低剂量组（15 mg kg-1）、牛膝总皂苷中剂量组（30 mg kg-1）、牛膝总皂苷高剂量组（50 mg kg-1），每组 12 只。除对比组外，其他各组大鼠在关节两侧进针，从第 1 天开始每间隔 2 d 分别注射 0.3 mL l5%木瓜蛋白酶水溶液（美国 Sigma 公司，批号：MFCD00131791）到大鼠膝关节腔内。随后采用 kquesne MG 评估方式，对大鼠膝关节进行评估，若评分4 分则表示模型建立成功；在建造好模型后第 7 天，让牛膝总皂苷低、中、高剂量组分别进行灌胃，计量分别为牛膝总皂苷 60、120、240 g/g，对比组和模型组用相等体积的水进行灌胃，每天 1 次，连续 1 个月。1.3观察指标（1）各组大鼠的炎症程度比较。给药完成后，对大鼠关节炎症进行评分，按照肿胀严重程度分为 5 级，0 分无肿胀、1 分为轻度、2 分为中度、3分为严重、4 分为变形。（2）各组大鼠膝关节软骨细胞miR-19a、SOX9、NF-B 表达水平比较。选用 TRIzol试剂，提取膝关节软骨细胞总 DNA，检测 miR-19a、SOX9、NF-B 基因水平。（3）各组大鼠膝关节软骨细胞SOX9、NF-B 蛋白表达水平比较。使用 1%的蛋白酶抑制剂检测缓冲液，得到膝关节软骨细胞总蛋白质，再使用 BCA 蛋白试剂盒检测其浓度。1.4统计学方法研究数据运用 SPSS 20.0 软件进行处理，计数资料以率（%）表示，行 2检验；计量资料以（x s）表示，行 t 检验。P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠膝关节软骨细胞 miR-19a、SOX9、NF-B 表达水平比较与对比组比较，模型组的miR-19a 表达水平较低，SOX9、NF-B 表达水平较高（P 0.05）；使用了牛膝总皂苷的 3 组，按照剂量的不同，miR-19a 表达水平从低剂量到高剂量依次增高（P 0.05），而 SOX9、NF-B 表达水平依次降低（P 0.05）。见表 1。2.2各组大鼠膝关节肿胀度程度比较与对比组比较，模型组的肿胀程度相对严重（P 0.05），使用了牛膝总皂苷的 3 组，按照剂量的不同，服用剂量从低到高关节肿胀程度依次减轻，牛膝总皂苷中剂量组肿胀程度表 1各组大鼠膝关节软骨细胞 miR-19a、SOX9、NF-B 表达水平比较（x s）组别鼠数剂量/（mg kg-1）miR-19amRNA对比组模型组牛膝总皂苷低剂量组牛膝总皂苷中剂量组牛膝总皂苷高剂量组10101010101530505.520