基于Notch1_Hes1...肌细胞凋亡和心室重构的影响_张驰.pdf

J Am J Alzheimers Dis，2018;33(8):535-40.11Whittington A，Sharp DJ，Gunn N.Spatiotemporal distribution of-amyloid in Alzheimer disease is the result of heterogeneous regionalcarrying capacities J J Nucl Med，2018;59(5):822-7.12Nguyen KV.Special issue:Alzheimers disease J AIMS Neurosci，2018;5(1):74-80.13Joachim L，Franziska FT，Frank E.Assessment of dynamic BCL-2protein shuttling between outer mitochondrial membrane and cytosolJ Methods Mol Biol，2019;1877(1):151-61.14Song Y，Zhong M，Cai FC.Oxcarbazepine causes neurocyte apoptosisand developing brain damage by triggering Bax/Bcl-2 signaling path-way mediated caspase 3 activation in neonatal rats J Eur ev MedPharmacol Sci，2018;22(1):250-61.15孙莉敏，刘丽芳，朱华旭，等.基于网络药理学的黄连解毒汤治疗阿尔兹海默症的作用机制研究 J 药学学报，2017;8(1):1268-75.16张茹兰，黄启辉，黄秀芳，等.黄连解毒汤含药血清对 A25 35诱导 HT22 细胞损伤的影响 J 中成药，2019;5(1):1017-22.17Hetz C，Saxena S.E stress and the unfolded protein response inneurodegeneration J Nat ev Neurol，2017;13(8):477-91.18Ather M，Mozammil SK.Endoplasmic reticulum stress:implicationsfor neuropsychiatric disorders J Chonnam Med J，2019;55(1):8-1919Xu T，Xu GL，Gu ZY，et al ole of endoplasmic reticulum stresspathway in hydrostatic pressure-induced apoptosis in rat mandibularcondylar chondrocytesJ Mol Cell Biochem，2017;429(1-2):23-31.20Yi SY，Shi WB，Wang H，et al Endoplasmic reticulum stress PEK-ATF4-CHOP pathway is associated with hypothalamic neuronal inju-ry in different durations of stress in ratss J Front Neurosci，2017;11(1):1-10.2022-03-29 修回(编辑张艳利)基于 Notch1/Hes1 信号通路探讨葛根素对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和心室重构的影响张驰徐莉任浩进徐超刘金华王丽岳(武汉市普仁医院，湖北武汉430081)摘要 目的探讨葛根素对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和心室重构的影响及关于缺刻基因(Notch)1/发状分裂相关增强子(Hes)1 信号通路表达的变化机制。方法将 96 只雄性 Wistar 大鼠(200 250 g)随机分成 3 组:对照组:进行假手术;模型组:按照模型制备操作结扎大鼠心脏冠脉;葛根素干预组:同模型组进行模型制备后 24 h 进行腹腔注射葛根素120 mg/(kgd)。3 组按照术后 1、2、3、4 w记录各时间点血液流变学指标后处死大鼠，运用 TUNEL 法及免疫组织化学法检测心肌细胞凋亡情况;Western 印迹检测心肌细胞凋亡基因蛋白及 Notch1/Hes1 信号通路蛋白的表达情况。结果模型组左心室功能较对照组显著降低(P0.05)，葛根素干预组左心室功能较模型组明显改善(P0.05);模型组与葛根素干预组心肌梗死面积差异显著(P0.05)，手术 4 w 后，模型组左心室重量较对照组显著上调(P0.05)，葛根素干预组左心室重量较模型组明显降低(P0.05);对照组未出现明显心肌细胞凋亡，模型组和葛根素干预组心肌梗死病灶附近均出现心肌细胞凋亡现象，但葛根素干预组较模型组显著改善(P0.05);术后1、3、4 w 时，模型组 B 细胞淋巴瘤(Bcl)-2 相关 X 蛋白(Bax)/Bcl-2 数值较相同时间的对照组显著上升(P0.05)，术后 3、4 w 时，模型组的 Bax/Bcl-2 数值较同组术后 1 w 时显著上升，且 4 w 时上升更加显著(P0.05)，4 w 时，葛根素干预组 Bax/Bcl-2 数值较模型组显著下降，葛根素干预能够明显激活 Notch1/Hes1 信号通路的表达(P0.01)。结论心肌梗死大鼠心肌细胞会发生明显凋亡现象，并且伴随左心室功能降低，使用葛根素进行干预能够通过促进 Bcl-2 抑制 Bax 基因的表达一定程度上减轻心肌细胞凋亡，有助于左心室功能改善及减轻心室重构，这些过程与其激活 Notch1/Hes1 信号通路的表达密切相关。关键词 缺刻基因(Notch)1/发状分裂相关增强子(Hes)1 信号通路;葛根素;心肌梗死;心肌细胞凋亡;心室重构中图分类号 332 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0623-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.031基金项目:湖北省卫生计生科研项目(WJ2019H152);湖北省卫生计生委 2017-2018 年度科研立项项目(WJ2017M200);武汉市卫生局临床医学科研项目(WX12D01)通讯作者:王丽岳(1972-)，女，博士，主任医师，主要从事心血管疾病研究。第一作者:张驰(1982-)，男，硕士，主治医师，主要从事心内科疾病研究。传统理论认为，心肌梗死发生时心肌细胞的首要表现就是坏死，但根据最新试验证实，长时间缺血会使心肌细胞发生明显凋亡的一系列特征，随后发生坏死1。心肌细胞凋亡的发生区域包括梗死中心区、边缘区甚至涉及远处的存活心肌细胞。持续进行的细胞凋亡会导致进行性心肌细胞丢失、细胞中胶原支架断开及心室壁的厚度下调，发生心室重构最终演变为心衰。细胞凋亡过程受多基因的共同调控，B 细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2 相关326张驰等基于 Notch1/Hes1 信号通路探讨葛根素对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和心室重构的影响第 3 期X 蛋白(Bax)分别是促进和抑制细胞凋亡的标志性基因，与凋亡过程相关2。葛根素属于中药葛根中的一种异黄酮化合物，其药理作用广泛，抑炎、抗凋亡、抗氧化及调节血管舒张等，被认为是能够用于治疗心肌梗死、心绞痛、冠心病等一系列心血管病的药用有效成分3 5。而目前，葛根素对于心梗造模大鼠的心脏一系列功能的影响和涉及的生物学机制尚不明确。缺刻基因(Notch)1/发状分裂相关增强子(Hes)1 信号通路属于一条保守进化的生物胞间转导通路，研究发现其对于细胞增殖、生长、分化和组织器官发育发挥一定作用，该通路活化也与多种炎症、氧化应激反应过程密切相关6 8。有研究指出，激活 Notch1/Hes1 通路能够具有心肌保护效应，而其是否参与了心肌梗死中的心肌保护过程未见相关报道9。本研究建立心肌梗死大鼠模型，基于 Notch1/Hes1 信号通路探讨葛根素对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和心室重构的影响。1材料与方法1.1一般材料雄性 Wistar 大鼠(购自中国科学院生物研究所)、葛根素(购自四川玉鑫药业有限公司)、戊巴比妥(购自陕西汉江药业股份有限公司)、HE 染液(索莱宝科技有限公司)、Notch1 的胞内片段(NICD)一抗及二抗、Hes1 一抗及二抗、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)一抗及二抗、p-蛋白激酶 B(Akt)一抗及二抗、Bcl-2 一抗及二抗、Bax 一抗及二抗(购自北京奥维亚生物技术有限公司)、原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测试剂盒(购自武汉普健生物科技有限公司)、蛋白酶 K(购自武汉普健生物科技有限公司)、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂(购自上海双赢生物科技有限公司)。1.2模型制备制备心肌梗死大鼠模型时，首先使用3%质量分数的戊巴比妥(剂量为40 mg/kg)进行腹腔注射麻醉，进行口气管固定之后连接呼吸机，从大鼠的左侧 3 4 肋骨间一步步打开胸腔及心包，待心脏暴露出来，使用丝线对大鼠冠脉前降支进行结扎，通过心电图可以观察到 ST 段明显抬高，心脏左室前壁发白，模型建造成功后，使肺部完全膨胀，排出胸腔的气体进行胸腔关闭。1.3分组将 96 只雄性 Wistar 大鼠(200 250 g)随机分成 3 组:对照组:进行假手术，穿线操作相同但不进行结扎;模型组:按照模型制备操作结扎大鼠心脏冠脉;葛根素干预组:同模型组进行模型制备后24 h 进行腹腔注射葛根素 120 mg/(kg d)，对照组和模型组均腹腔注射与其等量的生理盐水，1 次/d。3 组按照术后 1、2、3、4 w 记录各时间点血液流变学指标后处死大鼠，每组每个时间点 8 只大鼠。1.4血液流变学指标检测对大鼠麻醉处理固定后进行右颈总动脉的分离，插入 PE-50 导管于颈部总动脉，待数值稳定观察动脉收缩压(SBP)，再将导管移入左心室，通过 BL-420 生物机能实验系统对左室舒张末期压(LVEDP)、左室压上升(下降)最大速率(dp/dt max)进行测量。1.5大鼠心脏质量和心肌梗死面积检测各组大鼠处死后得到心脏，使用 0.85%氯化钠洗涤吸干水分后进行全心重量(THW)、左心室的实际重量(LVW)称量，分别除以大鼠整体体重(BW)，两者比值能够提示全心、左心室肥厚程度。沿左室长轴的垂直线将其均分 4 份，每一份中选取 5 m 心脏组织行苏木素-伊红(HE)染色，成像后进行分析，取心内、外膜表面的梗死瘢痕弧长和心内、外膜表面周长的均值。心肌梗死面积=(瘢痕外弧长+瘢痕内弧长)/(内周长+外周长)100%。1.6制备心肌组织切片各组大鼠处死后得到心脏，浓度为 0.85%的氯化钠进行反复冲洗后再运用10%的甲醛进行细胞 24 h 固定，经过石蜡包埋处理对心梗病灶周围 1 mm 以内的心肌组织沿左室轴线进行 4 m 厚石蜡切片处理，进行 HE 染色显微镜下观察，并通过 Western 印迹法检测 Notch1/Hes1 信号通路蛋白及 Bcl-2、Bax 蛋白表达。1.7检测心肌细胞凋亡通过 TUNEL 选取各组切片各 5 张，按照 TUNEL 试剂盒操作说明书进行检测。首先进行固定包埋切片，随后脱蜡处理，运用H2O2封闭处理 0.5 h，使用浓度为 25 mg/L 的蛋白酶 K 对膜、核蛋白进行消化，再向其中加入一定量的 TUNEL 反应液，室温条件下孵育1 h，添加抗荧光素抗体及 DAB 显色试剂，经过苏木素复染、脱水、透明操作后进行封片。在 400 倍视野观察每张切片的5 个不同视野总细胞数和细胞凋亡数目，凋亡系数=细胞凋亡数/总细胞数。1.8统计学方法采用 SPSS19.0 软件进行 SNK-q检验及方差分析。2结果2.1心肌梗死大鼠模型的制备结果建立心肌梗死大鼠模型后，大鼠的整体死亡率为 34.50%，模型组死 亡 率 为 16.50%，葛 根 素 干 预 组 死 亡 率 为1