温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,汇文网负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。
网站客服:3074922707
基于
Keap1_PGAM5
高脂血症
大鼠
影响
机制
裘雪莹
收稿日期:;修订日期:基金项目:国家自然科学基金项目();辽宁省“兴辽英才计划”项目();辽宁省教育厅项目(作者简介:裘雪莹(),女(汉族),辽宁大连人,辽宁中医药大学在读博士研究生,主要从事中西医结合防治心血管疾病研究工作通讯作者简介:贾连群(),女(汉族),辽宁营口人,辽宁中医药大学教授,博士研究生导师,博士学位,主要从事中西医结合防治心血管疾病研究工作基于 介导的氧死亡途径探讨健脾益气化瘀祛痰法对高脂血症大鼠的影响与机制裘雪莹,贾连群,宋 囡,隋国媛,曹 媛,王 群,王 杰,于 宁,孟嘉伟,张 琦,(辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室,辽宁 沈阳;辽宁中医药大学研究生学院,辽宁 沈阳)摘要:目的 探讨健脾益气化瘀祛痰法防治血脂异常的可能有效机制。方法 将 只 级 大鼠随机分为空白组、模型组、化瘀祛痰方组(),每组 只。模型组、化瘀祛痰方组采用高脂饲料喂养建立高脂血症模型,造模 周后灌胃给药,化瘀祛痰方组给予化瘀祛痰方进行灌胃,空白组及模型组给予相应体积的生理盐水灌胃。周后通过全自动生物化学分析仪检测甘油三酯(,),总胆固醇(,),高密度脂蛋白胆固醇(,)和低密度脂蛋白胆固醇(,)的含量;染色观察肝脏组织病理变化;酶联免疫吸附测定()检测肝脏组织中活性氧()、醌氧化还原酶(),和血红素加氧酶(,)的含量;法与实时荧光定量()检测肝脏组织中 样环氧氯丙烷相关蛋白 (,),核因子 相关因子(,),去磷酸化线粒体凋亡诱导因子(,),磷酸甘油酸变位酶(,)蛋白及 的表达。结果 与空白组相比,模型组大鼠血清、含量显著升高,含量显著降低(或 );肝脏脂肪变性脂肪空泡布满视野,肝细胞体积变大;肝脏组织中 含量显著升高,和 含量显著下降();肝脏组织中、及 蛋白和 的表达显著升高、蛋白和 的表达显著降低()。化瘀祛痰方可使、含量显著降低,含量显著升高(或 );脂肪变性程度明显缓解,肝细胞脂肪空泡明显减少;肝脏组织中 含量显著降低,和 含量显著升高(或 );肝脏组织中、及 蛋白和 的表达显著降低、蛋白和 的表达显著升高(或 )。结论 健脾益气化瘀祛痰法可能通过降低 介导的氧死亡相关通路的表达而减轻脂质沉积及肝脏损伤,从而防治血脂异常。关键词:氧死亡;活性氧;血脂异常;化瘀祛痰方;标识:中图分类号:文献标识码:文章编号:()血脂异常是临床上常见的体内脂质代谢紊乱性疾病,近 年来,中国人群的血脂水平日益升高,年我国成人血脂异常患病率就已高达 ,血脂异常及血脂异常导致的一系列疾病严重危害人类健康,是导致动脉粥样硬化、缺血性脑卒中、肝硬化的重要因素。祖国医学没有“血脂异常”的概念,研究发现现代医学“血脂”与中医“膏脂”在生物学角度基本一致,膏脂是肝脾代谢的重要产物。中医认为,膏脂沉积属本虚标实,气滞血瘀,痰浊内生,浊脂内聚而膏脂代谢异常为标;气血阴阳亏虚,肝失疏泄,脾失健运为本。课题组前期研究发现,以健脾益气化瘀 祛 痰 为 指 导 进 而 组 方 的 化 瘀 祛 痰 方(专 利 号:)对于缓解血脂沉积有明显效果,。近年研究发现,在多种调节性细胞死亡机制上与血脂调节相互作用,包括坏死、凋亡、焦亡、铁死亡等。然而,在 年,学者们发现了一个不同于以往的细胞死亡方式 氧死亡,作为新兴的细胞死亡方式,特点是由活性氧诱导的 非依赖性的凋亡样细胞死亡,其依赖于 信号通路。因此,本实验以 级大鼠为研究对象,以肝脏细胞氧死亡为出发点,探究化瘀祛痰方能否通过 介导的氧死亡,减轻脂质沉积及肝脏损伤,从而防治血脂异常,为健脾益气化瘀祛痰法防治血脂异常,进而防治临床心血管疾病提供依据。材料与仪器 实实验验动动物物 只 级 大鼠,体重(),动物合格证号(辽),辽宁长生生物科技股份有限公司提供。于辽宁中医药大学实验动物中心进行饲养,实验单位许可证号是(辽),单笼饲养,室内湿毒保持 ,温度保持,每天采取 昼夜明暗交替。实验动物符合辽宁中医药大学实验动物伦理委员会标准,实验动物伦理审查编号。实实验验药药品品 化瘀祛痰方组成:党参,绞股蓝,黄芪,茯苓,郁金,法半夏,丹参,川芎,石菖蒲,以上药物均由辽宁中医药大学附属医院实验中心提供并煎煮。主主要要试试剂剂与与仪仪器器、测定试剂盒(四川迈新生物技术有限公司提供,产品批号分别为,时珍国医国药 年第 卷第 期 ,);型全自动生化分析仪(日本东芝公司提供);苏木素 伊红()染色液(碧云天生物技术有限公司提供,产品批号);型普通光学显微镜(德国 公司提供);反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应()试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司提供,产品批号分别为,);(公 司 提 供,产 品 批 号);肝细胞活性氧簇()检测试剂盒、醌氧化还原酶()检测试剂盒、血红素加氧酶 ()检测试剂盒(酶免);、抗体(公司提供);冷冻高速离心机(美国 公司提供);,型酶标仪、型水浴恒温振荡器(其林贝尔仪器制造有限公司提供);型紫外可见分光光度计(日本岛津公司提供);电泳仪(产品型号 );垂直电泳槽(产品型号);转移电泳槽(产品型号 )。方法 动动物物分分组组与与干干预预 只 级健康 大鼠适应性喂养 周后,随机分为空白组、模型组、化瘀祛痰方组。空白组每日给予基础饲料,模型组和化瘀祛痰方组每日给予高脂饲料(猪油,蔗糖,胆固醇,胆酸钠,甲基硫氧嘧啶,配合 普通饲料),大鼠可以自由摄食,不限制饮水。周后,除空白组外,其余两组继续喂饲高脂饲料,与此同时进行灌胃给药,按照人和动物的体表面积折算系数并换算给药剂量,给予化瘀祛痰方组 ,每日供给空白组与模型组等体积的生理盐水,给药周期为 周。观观察察指指标标及及方方法法 取取材材方方法法 实验前 禁止进食,不禁水,大鼠称体重,用水合氯醛麻醉(水合氯醛),腹主动脉取血,室温静置 ,离心,取血清液,分装后()保存。取大鼠肝脏组织切成小块,部分 多聚甲醛固定,部分于 冷冻保存。血血脂脂检检测测 取材前,实验动物禁食不禁水,实验取材当天进行称重,用 水合氯醛进行麻醉,取实验动物腹主动脉血装于抗凝试管中,在室温下,静置 后,离心,取血清进行分装后,储存于 待用。使用全自动生物化学分析仪对、含量进行检测。肝肝脏脏组组织织病病理理形形态态 大鼠摘眼球采血结束后采用颈椎脱臼法处死大鼠,各组用随机数表法选取 只小鼠,无菌状态下打开腹腔,分离大鼠肝脏组织。肝脏组织固定于 多聚甲醛 以上,梯度脱水后石蜡包埋、切片,片厚约,常规 染色后封片,光学显微镜下观察。肝肝脏脏组组织织 、水水平平 各组大鼠取 肝脏组织研磨成匀浆液,用预冷 将其稀释为 肝脏组织匀浆液待用。、离心,离心半径为,取上清液。按照试剂盒说明测定、水平。法法检检测测肝肝脏脏组组织织 、蛋蛋白白表表达达水水平平 各组大鼠采用随机数表法选取 只大鼠,摘取肝脏过程同上,将组织蛋白裂解液加入各组大鼠的肝组织中,充分研磨,置于冰上 后,、离心半径 、离心,取上清备用。采用 蛋白含量测定试剂盒测定样品浓度。加入上样缓冲液,变性,每组按照 进行电泳,计算出每个样本上样体积。、浓缩胶电泳,、分离胶电泳。电泳结束后 恒压湿转,脱脂奶粉封闭,一抗孵育过夜,洗膜,二抗孵育,二抗稀释比例为 ,再洗膜,最后滴加发光液进行曝光,分析灰度值,以目的蛋白与内参蛋白灰度值比为目的蛋白表达水平。法法 检检 测测 肝肝 脏脏 组组 织织 、水水平平 取 肝脏组织,离心柱法提取总,按照试剂盒说明书进行操作,测得样本 浓度,将其稀释为 后反转录为,加入扩增反应体系,采用实时荧光定量 法,设定 反应条件:,个循环。检测各基因相对表达水平,结果用 表示。引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成,序列见表。统统计计学学方方法法 采用 软件进行统计分析,计量数据符合正态分布以?表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用 检验,以 为差异有统计学意义。表 、引物序列基因引物上游:下游:上游:下游:上游:下游:上游:下游:上游:下游:结果 各各组组大大鼠鼠血血脂脂水水平平比比较较 如表 示,与空白组相比,模型组大鼠血清中、水平显著升高(),水平显著降低()。与模型组相比,化瘀祛痰方组大鼠血清中、水平显著降低(或 ),水平显著上升()。各各组组大大鼠鼠肝肝脏脏组组织织病病理理形形态态学学 结果如图 所示,空白组肝小叶结构完整正常,肝细胞为圆形,细胞核居中,胞浆内未见脂滴,肝索排列整齐清晰,肝窦未见狭窄;模型组出现脂肪变性,肝细胞肿胀,胞浆内含有大量大小不等的脂肪空泡,肝窦狭窄或消失;化瘀祛痰方组脂滴明显减少,较模型组相比,脂肪变性程度减轻,肝小叶结构比较清晰,肝窦狭窄程度有所减轻。表 各组大鼠血清、含量比较(?)组别 空白组 模型组 化瘀祛痰方组 ,胆固醇;,甘油三酯;,低密度脂蛋白胆固醇;,高密度脂蛋白胆固醇;与空白组比较,;与模型组比较,图 各组大鼠肝脏病理形态学观察结果(,)各各组组大大鼠鼠肝肝脏脏组组织织 、水水平平比比较较 与空白组相比,模型组肝脏中 含量显著升高,和 表达量显著降低();与模型组相比,化瘀祛痰方组大鼠肝组织 含量显著降低、和 表达显著升高(或 )。见表。各各组组大大鼠鼠肝肝脏脏组组织织 、蛋蛋白白表表达达比比较较 如图 所示,与空白组相比,模型组大鼠肝脏、与 蛋白表达明显升高(),蛋白表达明显降低();与模型组相比,化瘀祛痰方组大鼠肝脏、与 蛋白表达明显降低(或 ),时珍国医国药 年第 卷第 期蛋白表达明显升高()。表 各组大鼠血清、含量比较(?)组别 空白组 模型组 化瘀祛痰方组 ,活性氧;,血红素加氧酶;,醌氧化还原酶;与空白组比较,;与模型组比较,各各组组大大鼠鼠肝肝脏脏组组织织 、表表达达比比较较 如图 所示,与空白组相比,模型组大鼠肝脏、与 表达明显升高(),表达明显降低();与模型组相比,化瘀祛痰方组大鼠肝脏、与 表达明显降低(或 ),表达明显升高()。,凋亡诱导因子;,样环氧氯丙烷相关蛋白;,磷酸甘油酸变位酶;,核因子 相关因子;与空白组比较,;与模型组比较,图 各组大鼠肝脏、蛋白表达情况(?)讨论血脂异常,是诱导心脑血管疾病重要的病理因素,使人体呈隐匿性、渐进性、全身性损伤趋势。目前对于血脂异常的中医证候研究尚无统一定论,根据其临床表现多将其归属于“痰湿”“血浊”“痰瘀”“肥胖”“脉痹”等范畴。肝脏是人体最重要的代谢器官之一,肝脏可以通过脂质合成、摄取、氧化等途径维持脂质代谢的稳定。“见肝之病,知肝传脾”,肝脾相互为用,当肝失疏泄,脾运化失司,水谷水液运化失常。水谷精微转输不利,精气血津液生成障碍,能量不足脾气推动无力;水液输布障碍,痰湿成饮生痰,痰浊膏脂凝聚,因痰致瘀痰瘀阻络,致使小肠泌别清浊,大肠传导功能失常,而膏脂代谢障碍。因此,本病属本虚标实,而“痰瘀互结”是其发生的主要病机,。本研究采用的化瘀祛痰方为国家专利药物,由党参、黄芪、茯苓、法半夏、绞股蓝、石菖蒲、川芎、丹参、郁金等组成,其活血、化瘀、祛痰之法,多用于治疗痰瘀互结之症。方中党参、黄芪、绞股蓝为君,益气健脾;茯苓渗湿利水,法半夏健脾燥湿,丹参活血祛瘀,川芎行气凉血,共为臣药;佐使药则以石菖蒲化痰泄浊,郁金行气化痰。诸药合用共奏益气健脾、化瘀祛痰之效。课题组前期研究发现,化瘀祛痰方能够减轻肝脏脂质沉积与脂质过氧化损伤。本实验研究结果显示,与空白组相比,模型组大鼠血清中的、水平含量明显升高,明显下降,染色结果显示脂质沉积和变性的效果更显著。与模型组相比,化瘀祛痰方组大鼠血清中、水平含量显著降低,明显升高,肝细胞脂肪变性和空泡程度也有不同程度的恢复,说明健脾益气化瘀祛痰法可以改善高脂血症大鼠肝脏脂质沉积的情况。,凋亡诱导因子;,样环氧氯丙烷相关蛋白;,磷酸甘油酸变位酶;,核因子 相关因子;与空白组比较,;与模型组比较,图 各组大鼠肝脏、表达情况(?)自 年 提出了氧死亡 或 在较高浓度下可以诱导的一种新的不依赖 而依靠活性氧诱导的凋亡样死亡后,氧死亡成为了一个新兴的研究发现。氧死亡是氧化应激诱导的细胞死亡之一,它的诱因始于,可以进一步导致蛋白质、脂质氧化,核酸断裂等,通过调节细胞的增殖和存活,在细胞信号