基于HMGB1_Becli...肾病综合征模型大鼠保护机制_罗亚丹.pdf

基于 HMGB1/Beclin-1 信号通路探讨雷公藤多苷对肾病综合征模型大鼠保护机制罗亚丹1袁立英1裘志成2何鸿3(遵义医科大学1 第三附属医院肾内科，贵州遵义563000;2 第一附属医院肾内科;3 遵义医药高等专科学校健康管理系)摘要 目的探讨雷公藤多苷对肾病综合征模型大鼠高迁移率族蛋白(HMG)B1/自噬效应蛋白(Beclin)-1 信号通路及炎性因子的影响。方法构建 SPF 级 Wistar 大鼠肾病模型与健康大鼠共同饲养形成对照组，选择雄性 SPF 级 Wistar 大鼠 60 只均分为 6 组:高剂量组、中剂量组、低剂量组、空白对照组、模型对照组及阳性对照组。使用尾静脉注射方法制成不同组别的大鼠差异。除空白对照组外，模型对照组、阳性对照组、低、中、高剂量组的大鼠均制成肾病综合征大鼠模型，通过在其尾部静脉注射盐酸阿霉素的方法制作肾病模型，空白对照组注射生理盐水。使用苏木素-伊红(HE)染色法对大鼠肾脏组织切片进行病理变化观察;使用酶联免疫吸附试验(ELISA)白细胞介素(IL)-4、IL-8 及肿瘤坏死因子(TNF)-的相对表达量;使用Western 印迹检测 HMGB1/Beclin-1 相关蛋白表达。结果与阳性对照组相比，雷公藤多苷治疗各组大鼠活跃度较高，精神好转，毛发渐有光泽。与空白对照组相比，阳性对照组中外周血的 TNF-、IL-4、IL-8 水平及肾组织的自噬微管相关蛋白 1 轻链(LC)3、HMGB1 和 Beclin-1 的蛋白表达水平显著提高(P0.05)，组织观察中，发现阳性对照组肾脏明显充血且出现与周围的结缔组织紧密相连的现，细胞膜表面存在的微绒毛明显减少，并且细胞形态发生不规则化，出现细胞核变形的现象，并且细胞核区染色质边缘发生聚集，肾脏细胞凋亡率显著升高(P0.05)。雷公藤多苷各治疗组和模型对照组相比，组织病理的微观损伤减轻明显，肾脏细胞凋亡率、TNF-、IL-4 和 IL-8 水平及 HMGB1、LC3、Beclin-1 蛋白因子的表达水平显著降低(P0.05)，且剂量的雷公藤多苷治疗呈现出显著剂量依赖性(P0.01)。结论雷公藤多苷可显著抑制炎性因子在肾病综合征模型大鼠的肾脏病理组织中的表达，调节 HMGB1/Beclin-1 信号通路，保护肾病综合征模型大鼠肾脏组织。关键词 雷公藤多苷;肾病综合征;HMGB1/Beclin-1 信号通路中图分类号 692 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0638-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.034基金项目:贵州省科技计划项目(黔科合 LH 字 2016 7422 号)通信作者:袁立英(1974-)，女，硕士，主任医师，主要从事原发性肾小球疾病研究。第一作者:罗亚丹(1981-)，女，副主任医师，主要从事肾小球疾病研究。肾病综合征(NS)是一种具有复杂发病机制的代谢综合征，表现为尿蛋白增加，高脂血症等1。目前，该病的临床治疗主要以激素干预为基础，但由于激素的不良反应和患者身体敏感性的差异，其效果有限2。MicroNA 是小非蛋白质单链 NA，可通过组织中的转录调节靶基因的表达。研究表明，Mi-croNA 参与了一系列过程，包括细胞发育、细胞凋亡和自噬2，3。研究发现4，mi-141 和 HMGB1/Beclin-1 之间的平衡是引起 NS 的重要原因。雷公藤多苷是一种具有强效的调节免疫作用与广泛性的消炎作用的生物大分子，它从雷公藤植物中提取3。本研究通过动物实验研究雷公藤多苷在治疗 NS 中的潜在应用价值及驱动这种效应产生可能的机制。1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物SPF 级的成年 Wistar 大鼠60 只，全部选用雄性，体重 200 250 g，8 周龄。实验用大鼠由北京维通利华动物实验技术有限公司提供，实验动物使用许可证号:SYXK(京)2014-0002。大鼠饲养于 SPF 级环境下，定时辐照灭菌，实验全程给予所有大鼠便捷自由的饮水和采食设备，随时观察大鼠状态，排除饲养过程中产生的系统误差。适应性喂养 1 w 后，开始实验建模。1.1.2实验用药雷公藤多苷片，每片 10 mg，使用时研磨成细粉。批准文号:国药 Z43020138，湖南千金谢利制药有限公司生产。1.1.3实验试剂注射用盐酸阿霉素，购自深圳万乐 药 业 有 限 公 司，产 品 批 号 为:国 药 准 字H44024359。醋酸泼尼松龙片，购自上海上药信谊药厂有限公司，产品批号为:国药准字 H31020771。兔抗大鼠 LC3 购自北京索莱宝科技有限公司，产品批号为:3950。肿瘤坏死因子(TNF)-酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(批号:E201609)、兔抗大鼠836中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷HMGB1 抗体(批号:11570-1-AP)、山羊抗大鼠 Bec-lin-1 抗体(批号:9144-3-CB)、白细胞介素(IL)-4ELISA 试剂盒(批号:P201912)和 IL-8 ELISA 试剂盒(批号:P201905)均由北京森和优生物有限公司生产。1.2实验方法1.2.1分组和建模60 只大鼠随机分为 6 个实验组。除空白对照组外其余组所有大鼠尾静脉注射盐酸阿霉素5 mg/kg，建立 NS 模型5。大鼠24 h 尿蛋白显著增加，说明模型成功建立6。空白对照组的大鼠注射等体积生理盐水。1.2.2药物处理模型建立 5 d 后开始进行药物处理。低、中、高剂量组分别给予 3、6、12 g/kg 雷公藤多苷灌胃处理;阳性对照组给予醋酸泼尼松0.2 g/kg灌胃处理;模型对照组和空白对照组每日给予等体积的蒸馏水。共持续 14 d，并且药物处理组固定时间给药，空白对照组于相同时刻灌胃蒸馏水。1.2.3检测方法1.2.3.1大鼠一般状态给药期间，观察大鼠毛发、进食量、精神、大便、体重情况等。1.2.3.2苏木素-伊红(HE)染色组织学观察给药结束后 24 h 观察组织，7.5 ml/kg 氨基甲酸乙酯麻醉大鼠并处死。从腹部取出肾脏组织，并分两部分保存，其中一份80冰箱保存，另一份 10%多聚甲醛常温保存。将固定好的肾脏组织包被在石蜡中，切片，进行 HE 染色。首先，应将固定好的切片放至显微镜下，调整视距使镜内的细胞细节清晰，然后观察切片组织发生的细胞病理学变化。病理学变化的程度以肾脏组织的病理学评分为标准，分别为:0 分:无充血、水肿、炎症浸润等现象的正常组织;1分:血管轻度水肿且组织界限模糊，表现为皮质及髓质模糊，并出现炎性浸润;2 分:组织明显充血水肿，肾皮质与髓质之间的界限消失，细胞的炎性浸润显著;3 分:肾组织各结构模糊不清，显著受损，血管模糊，细胞出现严重的炎性浸润。1.2.3.3TUNEL 法肾组织凋亡观察取出80放置的肾组织冷冻切片，加入 50 l 蛋白酶 K，37孵育 20 min，加入 TUNEL 反应液，37孵育 1 h，使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次切片，添加过氧化物酶结合抗体，37孵育1 h，孵育结束后，使用二氨基联苯胺(DAB)染色，然后用苏木素复染。脱水封片，并在显微镜下观察细胞凋亡情况。凋亡细胞核染色呈棕色。用 ImageJ 软件定量分析细胞凋亡率，细胞凋亡率(%)=棕色细胞数/细胞总数 100%。1.2.3.4外周血细胞 TNF-、IL-4、IL-8 含量的测定处死大鼠后，收集 10 ml 血液，并以 3 000 r/min进行离心，放置在 15 ml 离心管中离心 10 min，取上层分离的血清液采用 ELISA 检测血清中 TNF-，IL-4 和 IL-8 的水平。1.2.3.5ELISA 测定 HMGB1、LC3 与 Beclin-1 的蛋白表达水平将肾脏组织添加到 IPA 裂解缓冲液中，并放置于冰上，低温裂解 20 min。BCA 法处理样本，使用 96 孔分别添加，对样本进行总蛋白浓度定量，确定后续加样量，以进行 Western 印迹实验。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离转膜质量相等的蛋白质条带，添加一抗与-actin 内参(1 500)然后在 4 摇床孵育过夜。过夜后，先检查膜上是否有没浸润的地方，若浸润充分则使用 TBST 进行洗涤，洗涤 3 次，每次同样在摇床放置 5 min，提高洗涤效率。洗涤后，添加二抗(1 500)，使用电化学发光(ECL)试剂曝光显色，并使用 QuantityOne 软件分析相对蛋白质表达水平。1.3统计学方法采用 SPSS23.0 统计软件进行 t检验。2结果2.1大鼠一般状态比较空白对照组精神状态良好，反应灵敏，毛发光滑发亮，进食正常。模型对照组造模后第 7 天，大鼠尿量减少并伴有少量的腹水现象，精神状态日渐萎靡，进食减少，体重下降;造模后第 7 14 天，大鼠腹水显著增多，出现嗜睡、反应迟钝，有弓背耸肩现象，蜷卧少动，体毛发灰发暗，大便稀溏等体征;与模型对照组相比，低、中、高剂量组在 5 d 给药后，大鼠的活跃度较高，精神好转，毛发渐有光泽。2.2各组肾组织 HE 染色空白对照组肾脏大小正常且组织细胞边界清晰，无炎症，浸润未出现充血。模型对照组肾脏肿大，肾皮质与肾髓质出现分界模糊，血管充血症状，炎症和浸润明显。低、中、高剂量组上述症状程度较模型对照组轻。与空白对照组相比，模型对照组肾组织病理评分较高，且差异显著(P0.05);与模型对照组相比，药物处理各组的肾组织病理评分均较低，且差异显著(P0.05)。雷公藤多苷的治疗效果具有显著剂量依赖性(P0.01)。见图 1、表 1。936罗亚丹等基于 HMGB1/Beclin-1 信号通路探讨雷公藤多苷对肾病综合征模型大鼠保护机制第 3 期图 1各组肾组织形态(HE 染色，200)2.3各组肾组织凋亡比较与空白对照组相比，模型对照组与药物处理各组的凋亡细胞数量增加，且差异显著(P0.05);与模型对照组相比，药物处理各组肾脏中凋亡细胞数量降低，且差异显著(P0.05)。雷公藤多苷治疗效果具有显著剂量依赖性(P0.01)。见表 1，图 2。2.4各组肾组织 TNF-，IL-4，IL-8 含量比较与空白对照组相比，模型对照组及药物处理各组 TNF-、IL-4、IL-8 含量增加，且差异显著(P0.05);与模型对照组相比，药物处理各组肾脏中 TNF-、IL-4 和IL-8 的含量降低，且差异显著(P0.05)。雷公藤多苷的治疗效果具有显著剂量依赖性(P0.01)。见表 1。表 1各组肾组织病理评分、凋亡及 TNF-、IL-4、IL-8 表达比较(xs，n=10)组别肾组织病理评分(分)凋亡率(%)TNF-(ng/ml)IL-4(ng/ml)IL-8(ng/ml)空白对照组0.00.03.310.890.230.090.130.090.220.07模型对照组2.530.311)37.634.391)1.330.191)1.140.371)1.550.291)阳性对照组1.340.491)2)34.414.821)2)0.570.131)2)0.490.101)2)0.610.221)2)低剂量组2.120.591)2)25.762.371)2)1.130.011)2)0.900.191)2)1.140.161)2)中剂量组1.760.731)2)3)24.432.921)2)3)0.880.241)2)3)0.700.191)2)3)0.800.151)2)3)高剂量组1.34 0.681)2)3)4)22.122.841)2)4)0.800.241)2)4)0.770.071)2)4)0.780.171)2)4)与空白对照组比较:1)P0.05;与模型对照组比较:2)P0.05;与低剂量组比较:3)P0.05;与中剂量组比较:4)P0.05;表 2 同2.5各组肾组织中 HMGB1/Beclin-1 信号通路的蛋白表达对比与空白对照组相比，模型对照组及药物处理各组 HMGB1、LC3、Beclin-1 蛋