基于iTRAQ蛋白组学技术...候”唾液差异表达蛋白的研究_巩振东.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：陕西省教育厅重点实验室研究项目（）；陕西省中医药管理局研究项目（）；陕西省科技厅研究项目（；）；陕西省中医药管理局中医藏象理论重点研究室建设项目（陕中医药发 号）；陕西中医药大学中医经典理论研究创新团队建设项目（）；陕西省咸阳市中医体质与疾病防治重点实验室重点研发计划项目（）作者简介：巩振东（），男（汉族），山东蓬莱人，陕西中医药大学副教授，硕士学位，主要从事中医内科学的教学、科研及临床工作通讯作者简介：李翠娟（），女（汉族），山东沂南人，陕西中医药大学教授，博士学位，主要从事中医基础理论及黄帝内经的教学、科研及临床工作基于 蛋白组学技术的“正常体质 肾虚体质 肾虚证候”唾液差异表达蛋白的研究巩振东，李翠娟，孙理军，史鹏云，胡 勇，（陕西中医药大学，陕西 咸阳；陕西省中医体质与疾病防治研究重点实验室，陕西 咸阳）摘要：目的 比较正常体质 肾虚体质 肾虚证候动态演变过程中唾液差异表达蛋白。方法 根据中医“恐伤肾”理论，运用猫吓孕鼠方法制肾虚体质功物模型，在此基础上，肌注氢化可的松注射液制作肾虚证候动物模型，应用 检测各组大鼠唾液蛋白组学变化，并利用生物信息学软件进行分析。结果 肾虚体质组与正常体质组筛选出 个差异蛋白，上调 个，下调 个，肾虚证候组与正常体质组筛选出 个差异蛋白，上调 个，下调 个，肾虚证候组与肾虚体质组筛选出 个差异蛋白，上调 个，下调 个。对差异蛋白进行 分类、通路的富集度、网络构建分析发现，主要涉及代谢途径、抗原处理和呈现、信号转导通路、补体和凝血级联、唾液分泌、信号通路、溶酶体等等。、四种蛋白不仅在蛋白质相互作用中处于较为关键位置，而且与正常体质组比较，肾虚体质组、肾虚证候组、均降低，、均升高，与肾虚体质组比较，肾虚证候组、升高。结论 伴随着“正常体质 肾虚体质 肾虚证候”的动态演变过程，唾液中的蛋白质组学确实发生了变化，、蛋白可能为肾藏象相关疾病发生发展过程中的潜在生物标志物。关键词：正常体质；肾虚体质；肾虚证候；蛋白组学 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）体质不仅决定健康状况，而且是临床辨证的基础，体质的差异性决定着发病后临床证候类型的倾向性。肾虚体质是临床常见的病理体质类型之一，肾虚体质之人，患病之后更容易出现肾虚证候的症状与体征。很多老年性及慢性疾病肾虚证候均由肾虚体质发展而来，并且一旦发展为肾虚证候，肾虚、精亏的表现往往更为明显。“肾在液为唾”是中医藏象理论的重要内容，素问宣明五气云：“五脏化液肾为唾”，认为唾由肾中精气所化，肾中精气沿足少阴肾经到达舌下，泌泄津液而出则为唾。临床上肾之功能的盛衰变化会影响唾液的分泌与排泄。前期研究也发现，伴随着正常体质 肾虚体质 肾虚证候的动态演变过程，唾液中的生化指标和代谢物均发生了相应的变化，。为了进一步深入探讨“肾在液为唾”的理论内涵，揭示疾病发生发展的内在变化规律，本实验通过制备正常体质、肾虚体质、肾虚证候动物模型，采用 技术研究不同肾虚状态下的唾液蛋白表达差异，探索肾虚发生发展过程中可能的唾液生物标志物，寻找其预防靶标，为临床防治肾藏象相关疾病提供理论依据。材料与仪器 实实验验动动物物 月龄 大鼠 只，雌雄各半，体重（），购于西安交通大学实验动物中心，合格证编号：（陕）。主主要要试试剂剂与与仪仪器器 毛果芸香碱，湖北广奥生物科技有限公司生产；氢化可的松注射液，华中药业股份有限公司生产；二硫素糖醇（）、碘乙酰胺（）、测序级胰蛋白酶，公司生产；丙酮、乙醇、甲酸、乙腈、蛋白定量试剂盒，公司生产；异丙醇、标试剂盒，公司生产；超高压纳升级液相色谱，公司；超高压液相色谱，公司生产生产；质谱仪，公司生产。方法 造造模模及及分分组组 将 只大鼠，随机分为、两组，雌雄各半，分笼饲养，自由饮食饮水。适应性喂养 周后，各组大鼠按：比例雌雄合笼，确认受孕成功后，将所有孕鼠分笼单独喂养。组孕鼠放置于安静处，正常条件喂养直至产仔，从仔鼠中随机抽取 只，雌雄各半，作为正常体质组；组孕鼠根据中医“恐伤肾”理论，运用猫吓鼠方法进行惊吓直至产仔。猫与孕鼠仅一笼之隔，猫可以在鼠笼周围随意活动，孕鼠能被猫爪碰到但无法被抓到，每天惊吓 次，每次 个小时。仔鼠出生后随机抽取 只作为肾虚体质组和肾虚证候组，每组 只，雌雄各半。所有仔鼠正常条件喂养 周后称重，肾虚证候组每天肌注氢化可的松注射液 ，正常对照组和肾虚体质组仔鼠每天肌注等量生理盐水，共 天。取取材材 造模结束后，所有大鼠水合氯醛麻醉，腹腔注射 毛果芸香碱（）促进唾液分泌，管收集大鼠唾液，离心，收集上清液，于 保存备用。唾唾液液蛋蛋白白质质组组学学检检测测 将样品加入裂解液和变性剂，振荡混悬溶解，离心去除沉淀。用 法进行蛋白定量。按试剂盒提供方案进行还原、封闭。向各组蛋白溶液中加入胰酶，温育。将标记试剂稀释后与对应样品混合进行反应，然后加入去离子水 时珍国医国药 年第 卷第 期使标记物失活，混合样品，冻干。分别进行第一维强阳离子柱分离、第二维反相液相色谱、质谱鉴定。利用 软件检索质谱分析所得数据，筛选差异蛋白。运用 软件分析各蛋白生物学过程及分子功能，运用 软件从生物过程、细胞成分、分子功能注释对蛋白进行分类，选择 数据库对蛋白所涉及的通路进行分类和富集分析。数数据据处处理理 使用 数据库：，的质谱分析由 质谱仪完成。根据原始的 ，选取 且 或 为差异蛋白筛选标准，所得出的结果进入分析。利用生物学工具 对鉴定的差异蛋白进行 功能注释，主要包括生物过程、所处的细胞位置以及发挥的分子功能信息。同时应用 数据库进行蛋白功能网络的相互作用分析，并使用 进行富集分析。结果 各各组组大大鼠鼠唾唾液液标标本本中中差差异异表表达达蛋蛋白白分分析析 利用统计学方法筛选差异表达蛋白，筛选标准设定为 且 或 ，结果见表。表 各组差异蛋白定量统计结果差异比较组上调差异蛋白下调差异蛋白所有差异蛋白肾虚体质组 正常体质组肾虚证候组 正常体质组肾虚证候组 肾虚体质组由于各组筛选出的差异表达蛋白数量较多，各组间只列出差异明显的前 个，分别见表 。通过交叉对比分析也发现，与正常体质组比较，肾虚体质组、肾虚证候组、均降低，、均升高，且肾虚证候组、较肾虚体质组升高。表 肾虚体质与正常体质差异蛋白筛选（）表达 与正常体质组比较，表示表达上调，表示表达下调 差差异异蛋蛋白白的的 注注释释富富集集分分析析 利用生物学工具 对差异蛋白进行功能富集性分析。对差异表达蛋白通过生物进程（），细胞组分（），分子功能（）三个功能分类进行展示。将每组筛选的差异蛋白进行 分类，结果表明：表 肾虚证候与正常体质差异蛋白筛选（）表达 与正常体质组比较，表示表达上调，表示表达下调表 肾虚证候与肾虚体质差异蛋白筛选（）表达 与肾虚体质组比较，表示表达上调，表示表达下调与正常体质组比较，肾虚体质组在 方面，这些差异蛋白主要位于细胞外间隙、胞外外体、血液微粒、细胞外区、细胞外基质、结合珠蛋白血红蛋白复合物、髓鞘、中间丝、细胞骨架、神经元投射等。在 方面，这些差异蛋白主要参与了内肽酶活性的负调节、急性期反应、对锌离子的反应、慢性炎症反应、星形细胞发育、免疫应答、对脂多糖的反应、对药物的反应、白细胞介素 的细胞反应等生物学过程。在 方面，这些差异蛋白主要涉及丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性、结构分子活性、抗氧化活性、糖蛋白结合、内肽酶抑制剂活性、氧结合、类固醇结合、结合珠蛋白结合、样受体 结合等方面。与正常体质组比较，肾虚证候组在 方面，这些差异蛋白主要位于细胞外间隙、胞外外体、血液微粒、内质网内腔、细胞外时珍国医国药 年第 卷第 期 区、髓鞘、内质网伴侣复合物、细胞外基质、内质网、膜等。在 方面，这些差异蛋白主要参与内肽酶活性的负调节、过氧化氢分解过程、运输、参与细胞蛋白分解代谢过程的蛋白水解（）、对有机物质的反应、对脂多糖的反应、胰岛素代谢过程、蛋白水解、细胞迁移的正调控、慢性炎症反应等生物学过程。在 方面，这些差异蛋白主要涉及丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、层粘连蛋白结合、氧结合、结合珠蛋白结合、钙离子结合、结构分子活性、丝氨酸型内肽酶活性、酸性磷酸酶活性、抗氧化活性、肌动蛋白结合等方面。与肾虚体质组比较，肾虚证候组在 方面，这些差异蛋白主要位于细胞外间隙、胞外外体、血液微粒、细胞外区、内质网内腔、髓鞘、质膜外侧、细胞外基质、粘着斑、内质网高尔基中间室等。在 方面，这些差异蛋白主要参与内肽酶活性的负调节、急性期反应、免疫应答、抗菌体液反应、视网膜稳态、细菌防御反应、白细胞介素 的细胞反应、对药物的反应、对脂多糖的反应、器官再生等生物学过程。在 方面，这些差异蛋白主要涉及丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、内肽酶抑制剂活性、半胱氨酸型肽酶活性、糖蛋白结合、类固醇结合、半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性、抗氧化活性、半胱氨酸型内肽酶活性、结构分子活性、酶结合等方面。差差异异蛋蛋白白的的 分分析析 京都基因与基因组百科全书 数据库（），储藏了大量的基因和基因组的功能信息，将膜转运、代谢、信号传递等细胞生化过程的信息以图解的形式展现出来。本实验对筛选出的差异蛋白显著富集的代谢通路进行分析，结果如下：肾虚体质组与正常体质组对比，共检索出 条途径，至少有 个差异蛋白参与的生物途径有 条。其主要参与有代谢途径、信号转导通路、疟疾、流体剪切应力与动脉粥样硬化、非洲锥虫病、补体和凝血级联、吞噬体、癌症中的蛋白多糖、抗原处理和呈现。肾虚证候组与正常体质组对比，共检索出 条途径，至少有 个差异蛋白参与的生物途径有 条。其主要参与代谢途径、信号通路、唾液分泌、内质网蛋白质加工、溶酶体等。肾虚证候组与肾虚体质组对比，共检索出 条途径，至少有 个差异蛋白参与的生物途径有 条。其主要参与代谢途径、抗原处理和呈现、内质网蛋白质加工、细胞凋亡、溶酶体、癌症中的蛋白多糖、阿米巴病、吞噬体、信号转导通路、血小板活化、补体和凝血级联、唾液分泌、碳代谢、信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化等。差差异异蛋蛋白白的的 网网络络构构建建分分析析 蛋白质在行使生物功能时通过形成（蛋白质 蛋白质相互作用）网络以维持时间和空间上的协调一致，构建差异蛋白的相互作用网络，可以从蛋白质组层面发现差异蛋白的变化趋势，进一步帮助我们寻找差异蛋白中的关键节点。本实验通过查询 数据库，构建了差异蛋白的网络互作图。肾虚体质组与正常体质组相比，有 种差异蛋白，和 独立一个相互作用网，种蛋白形成一个相互作用网，占所有蛋白质的，余 种蛋白不在相互作用网内，发现、等在蛋白质相互作用分析时处于较关键位置，见图。肾虚 证 候 组 与 正 常 体 质 组 相 比，有 种 差 异 蛋 白，独立一个相互作用网，种蛋白形成一个相互作用网，占所有蛋白质的，余 种蛋白不在相互作用网内，发现、等在蛋白质相互作用分析时处于较关键位置，见图。肾虚证候组与肾虚体质组相比，有 种差异蛋白，独立一个相互作用网，种蛋白形成一个相互作用网，占所有蛋白质的，余 种蛋白不在相互作用网内，发现、等在蛋白质相互作用分析时处于较关键位置，见图。通过对比分析，在这些网络中发现一些重要的与正常体质 肾虚体质 肾虚证候动态发展密切相关的蛋白，主要集中在、，这四种蛋白不仅在蛋白质相互作用中处于比较关键位置，而且与正常体质组比较，肾虚体质组、肾虚证候组、均降低，、均升高，与肾虚体质组比较，肾虚证候组、升高，提示这四种蛋白的变化与肾虚体质、肾虚证候的形成发展密切相关，可能为肾藏象相关疾病发生发展的生物标志物。图 肾虚体质组与正常体质组差异蛋白相互作用网络图图 肾虚证候组与正常体质组差异蛋白相互作用网络图图 肾虚证候组与肾虚体质组差异蛋白相互作用网络图 讨论肾 唾相关理论是肾藏象理论的重要内容。唾液是人体重要的体液之一，临床上，唾液的分泌与排泄与肾之功能的盛衰变化密切相关。若肾之精气不足，或肾中元阴、元阳不和，温煦、蒸化、摄纳、封藏等功能失常，则可出现唾液分泌的异常，表现出多唾、久唾或少唾、口舌干燥，甚至完全无唾等症状。时珍国医国药 年第 卷第 期肾虚体质是临床常见的一种病理体质类型，