基于G-四链体的生物传感器...食品污染物检测中的研究进展_缪金伟.pdf

基于 G-四链体的生物传感器在食品污染物检测中的研究进展缪金伟(东营职业学院生物与生态工程学院东营257091)缪金伟男，硕士，讲师，主要从事用于外泌体分离检测的纳米材料和各类生物分子的电化学检测研究。E-mail:dyzyxymjw126com2022-06-15 收稿，2022-09-15 接受摘要食品污染物不仅对人类健康造成了严重威胁，还会给食品工业造成巨大的经济损失。G-四链体(G4)是由鸟嘌呤的碱基配对形成的核酸三维二级结构，具有灵活的绑定能力，已成为生物传感器的重要组成部分。将 G4 与生物传感器结合用于食品中污染物的检测得到了广泛的应用。本文对 G4 进行了简介，综述了 20152022 年间 G4 在食品污染物检测中的研究进展，并对其未来的发展趋势进行了展望。关键词生物传感器食品污染物检测G-四链体esearch Progress of G-Quadruplex-Based Biosensorin Food Contamination DetectionMiao Jinwei(School of Biological and Ecological Engineering，Dongying Vocational College，Dongying，257091)AbstractFood contaminants not only pose a serious threat to human health，but also cause huge economiclosses to the food industry G-quadruplex(G4)is a three-dimensional secondary structure of nucleic acid formed bypairing four guanine bases，which has flexible binding ability，and it has become an important part of biosensors Thecombination of G4 and biosensor has been widely used in the detection of food contaminants In this paper，theconstruction methods of G4 is introduced，the research progress of G4 in the detection of food contaminants from 2015to 2022 is reviewed，and the development trend of G4 in the future is prospectedKeywordsBiosensor，Food contaminant，Detection，G-quadruplex食品安全一直是人们关注的重要问题。随着食品供应的全球化，确保食品安全至关重要。不安全的食物往往可以导致各种疾病，严重者甚至会导致食用者死亡1，2。目前，严重的食品安全问题往往是由食品污染物引起的。食品污染物的来源多种多样，如农药的滥用、食源性致病菌的污染、毒素的产生以及食品加工过程中有害化学物质的形成3。因此，为确保食品安全，食品污染物的测定和监测具有重要意义。为发展定性/定量检测食品污染物，研究者们已经开发了多种方法。常用的光谱检测法有气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)、拉曼、荧光和紫外可见光谱法，这些方法不需要大量破坏食品样本，但往往受到吸收峰重叠、检测特异性差、耗时长、需要专业操作等问题的限制4。另外，生物学检测方法，如免疫分析(ELISA)、酶抑制、快速抗菌筛选试验(FAST)、侧流试验条(LFTs)和生物传感等，也被广泛用于食品中的污染物的快速分析57。虽然这些方法具有灵敏度高和特异性强等优点，但由于食物基质和热不稳定性的干扰，这些方法可能会产生假阳性的结果。开发高效、低成本、准确、灵敏、方便的生物传感器，实现对食品污染物的准确检测，对保障食品安全和人类健康具有非常重要的意义。G-四链体(G4)是由鸟嘌呤富集的核酸序列构建而成的一种特殊的高阶 DNA 结构8，9。G4具有性价比高、易合成、适应化学改性等优点，可以用于目标识别和信号转导，因而在生物传感平台中具有广阔的应用前景10。其中，G4 作为识别单元，它对靶标具有很高的特异性和亲和力;作为信号转换单元，可通过多种信号输出满足不同生物传感平台(荧光、电化学、比色等)的需872化学通报2023 年 第 86 卷 第 3 期http:/wwwhxtborgDOI:10.14159/ki.0441-3776.2023.03.010求11，12。因此，基于 G4 的生物传感器在医学、环境监测和食品工业等领域得到了广泛的研究和应用。本文拟在简单介绍 G4 的基础上，综述在20152022 年间基于 G4 的生物传感器在食品污染物检测中的研究进展，并对其未来的发展趋势进行展望。1G-四链体1962 年首次发现了鸟嘌呤(G)四链体，自组装 G4 核酸结构不同于典型的双螺旋结构13，G4是由四个鸟嘌呤碱基通过 Hoogsteen 氢键配对形成的一种稳定的共面四方二级结构14。G4 结构具有多种构象，可以由两个、三个或多个 G4 叠加而成。根据链的方向，G4 结构可以分为平行、反平行和混合(平行和反平行的混合)结构(图 1)，这主要是由于 G4 的构象通常受核苷酸链的数量和极性、阳离子类型和结合靶点等多种因素的影响15，16。由于其独特的结构和增加的热力学和化学稳定性，G4 有许多其他核酸结构不具备的优点，如热稳定性好、免疫原性低、酶活性可调以及可编程性好等17。另外，由于 G4 结构的负电荷密度是双链 DNA 的两倍，因此，G4 可以大大提高其与荷正电配体的静电相互作用。目前，G4 广泛应用于检测有机分子、核酸和金属离子的生物传感器。图 1G4 的不同结构Fig1The different stureture of G42G4 形成的 DNAzyme脱氧核酶于 1994 年首次合成，单链 DNA 序列显示出酶活性。在稳定金属离子存在的情况下，富含鸟嘌呤的序列与含铁卟啉血红素结合，折叠成 G4，极大地提高了血红素(Hemin)的催化活性18。通过模拟辣根过氧化物酶(HP)的DNAzyme 用于催化 H2O2的还原和底物(3，3，5，5-四甲基联苯胺硫酸盐(TMB)、鲁米诺、2，2-氨基二氮(3-乙基苯唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、苯胺、对苯二酚(HQ)以及邻苯二胺(OPD)的氧化1923，能进一步引发后续反应，提高催化活性和检测灵敏度(图 2)。值得注意的是，DNAzyme能够很好地避免天然蛋白酶产生的不溶性沉淀，从而 减 少 阻 断 氧 化 还 原 探 针 的 电 子 转 移 过程24，25。通过 G4 和适配体或其他生物组分的结合，研究人员正试图开发新的生物传感器并拓宽其应用。因此，G4 已成为高选择性和高灵敏度的生物传感的通用工具。图 2G4 形成的 DNAzyme 催化 TMB 显色的机理Fig2Mechanism of TMB color development catalyzedby DNAzyme formed by G43G4 作为识别单元用于食品污染物检测作为识别单元，G4 对赭曲霉毒素 A(OTA)、Pb2+等靶点具有较高的特异性和亲和力，因此，G4可以用于食品基质中污染物的灵敏检测。3.1真菌毒素检测无论是在人类食品还是动物饲料中，真菌毒素的存在都威胁着食品安全和人类健康。各国政府和国际组织对食品中的真菌毒素残留量制定了严格的限制。为使真菌毒素水平保持在这些限度以下，建立可靠和敏感的真菌毒素监测方法是非常必要的26，27。基于 G4 的生物传感器作为一种有前景的真菌毒素检测工具受到越来越多的关注。作为小分子毒素，OTA 和黄曲霉毒素 B1(AFB1)可以与特定的 DNA 序列发生特异性反应，从而形成或破坏 G4 结构，达到检测的目的。例如，Li 等28 构建了一种基于 G4 的荧光传感器用于 AFB1 的检测。荧光染料硫黄素 T(ThT)与抗 AFB1 的 G4(G4/ThT)结合形成的复合物能够显著提高 ThT 的荧光强度。当 AFB1 存在时，游离的 AFB1 适配体会破坏 G4 的结构，从而降低荧光强度，达到检测的目的。该方法对植物源性食品中 AFB1 的检测限为 1ng/mL，同时整个检测过程在 20min 内即可完成。这种 G4/ThT 荧光探针972http:/wwwhxtborg化学通报2023 年 第 86 卷 第 3 期具有水溶性、成本效益、操作简单、灵敏度好、背景信号低等优势，在食品分析检测中有很大的应用潜力。研究表明，OTA 的酚环体系与 G4 存在-堆叠作用。这种 OTA 与其 G4 适配体结合机制促进了基于 G4 的 OTA 检测生物传感器的构建。基于此，研究人员建立了用于 OTA 检测的高灵敏度、无标记的 G4 荧光传感器。另外，由于 OTA 本质上是一种荧光酚类物质，OTA 与其适配体之间的-堆叠相互作用也可以触发 G4-OTA 之间的能量转移，从而提供了一种新的能量转换机制“打开”荧光信号。Armstrong 等29 报道据此构建了“打开”的荧光信号平台，使得适配体-OTA 复合物的荧光远远强于游离的毒素。G4-OTA 复合物在256nm 处的选择性激发可使 OTA 荧光增强 4 倍。G4-OTA 能量转移平台对 OTA 的检测限为 2ng/mL，这种检测灵敏度与荧光共振能量转移免疫分析平台类似。此外，Deore 等30 构建了 G4 特异性配体驱动的 G4-G4 纳米装置作为无标记适配体传感器检测 OTA。作者采用 H-Telo22-配体相互作用作为 G4-G4 纳米器件的模型。当 OTA 不存在时，OTA 结合适配体折叠成反平行的 G4。结果表明，当荧光染料引起 OTA 结合适配体(平行或混合)拓扑结构变化时，OTA 介导的染料置换具有出色的 OTA 检测灵敏度。然而，当荧光染料未能在 OTA 结合适配体的反平行折叠中诱导构象变化时，将 OTA 添加到适配体-染料复合物中会导致染料置换不佳，OTA 检测的发射响应较弱。这种检测方式作为一种概念验证，为基于 G4的荧光传感器用于 OTA 检测提供了重要思路。3.2金属离子检测食品中的重金属离子主要来自环境。重金属污染正威胁着全球粮食安全和人类健康。有效监测食品和环境中重金属含量是控制食品中重金属污染的重要手段之一31。与传统的仪器分析(如电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法和原子发射光谱法等)相比，生物传感方法可以提高重金属离子的检测效率，使现场分析成为可能32。许多重金属离子，包括 Tl+、Pb2+、Ag+、Hg2+、Cd2+可以通过错配或其他相互作用与 DNA探针结合，使 DNA 探针的结构产生特殊的构象转变。G4 是一种常用的重金属离子 DNA 探针。Khoshbin 等33 构建了基于 Pb2+适配体从无规线圈到 G4 结构的构象转换的超灵敏纸基生物传感器，其主要是利用 Frster 共振能量转移(FET)过程和氧化石墨烯(GO)片的超荧光猝灭特性。在纸基平台上注入 Pb2+时会诱导特定适配体从 GO 表面释放，从而恢复荧光发射。Pb2+不存在时，荧光发生猝灭。利用 GO 薄片的荧光猝灭特性，大大降低了背景信号，能够检测出0.5pmol/L 的 Pb2+。同时，该方法可在 10min 内实现对 Pb2+进行超灵敏检测。该纸基生物传感器具有简单、高效的特性，此外，通过取代目标特异性适配体，该方法还可用于检测其他金属离子。由于实际样品总是含有多种重金属离子。在这种情况下，同时分析多个目标的适配体传感器可以使检测过程更加方便。G4 可以在多种重金属离子同时测量中发挥多种作用。Lu 等34 建立了一种基于荧光标记适配