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2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 基于HPLC指纹图谱、多指标成分含量测定结合化学计量学的怀牛膝质量评价王彦夫，刘艳，杨琬琪，匡海学，杨炳友（黑龙江中医药大学教育部北药基础与应用研究重点实验室 哈尔滨 150040）摘要：目的本实验采用HPLC方法建立来自3个产地15批怀牛膝药材的指纹图谱，并对-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮进行含量测定，同时通过化学计量学的方法对15批怀牛膝进行质量评价。方法选用Waters SunFire C18（150 mm4.6 mm，5 m）色谱柱，检测波长280 nm，以乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱，流速为1.0 mLmin-1，柱温25，进样量10 L。以-蜕皮甾酮峰为参照峰，运用软件 中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对15批怀牛膝药材进行相似度分析，使用Metabo Analyst 5.0网站进行聚类热图分析，使用SIMCA 14.1软件进行PCA和PLS-DA分析。结果标定了31个共有指纹峰，指认了3个已知成分，并对其进行含量测定，化学计量学分析结果将15批怀牛膝药材样品分为3类，并且筛选了不同产地间潜在的差异性成分。结论该方法具有良好的精密度、重复性以及稳定性，可为怀牛膝的质量评价与控制提供科学依据及参考。关键词：怀牛膝 指纹图谱 含量测定 化学计量学 质量评价doi:10.11842/wst.20210923009 中图分类号:R284.1 文献标识码:A牛膝为苋科植物牛膝 Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，主产于河南，全国各地均有栽培，道地产区为河南省焦作市，为“四大怀药”之一，习称其为怀牛膝。2020版 中国药典1记载其具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行的功效。临床上常用于急性咽炎、高血压、痛风性关节炎、引产、功能失调性子宫出血等症。国内外研究报道表明牛膝根内含有皂苷类、甾酮类、多糖类、生物碱等成分2-7。其中，甾酮类化合物为牛膝的主要成分之一，具有抗肿瘤、镇痛抗炎、抗骨质酥松等活性8-10。牛膝药材质量受多因素影响，不同产地的牛膝药效有显著差异，这可能是因为不同产地的牛膝所含的化学成分不同或其部分化学成分的含量有所不同。含量测定为历代 中国药典 中判定药材质量的常用方法，具有方法简单、成本低、易操作等优点11，现2020版 中国药典 中对牛膝的质量标准仅以-蜕皮甾酮含量判断不够全面。随着中药指纹图谱的研究越来越深入，将指纹图谱作为质量控制的方法得到了广泛应用，中药指纹图谱可对成分复杂的中药材及制剂，进行色谱分析得到丰富的化学信息，从而实现对不同中药材及制剂的质量控制12。化学计量学的出现及应用更是将指纹图谱中所包含的化学信息提取并数字化，可对大量样品进行全面准确的鉴别归类，为中药材的质量控制提供了极大的便利13。因此本实验通过多指标含量测定并建立HPLC指纹图谱，结合化学计量学对河南省不同产地的怀牛膝药材建立更加全面的怀牛膝质量评价方法，为怀牛膝的质量评价提供参考。收稿日期：2021-09-23 修回日期：2022-10-26 国家科学技术部国家重点研发计划（2018YFC1707103）：中药饮片智能化生产模式及一致性评价研究，负责人：杨炳友；黑龙江省委、省政府黑龙江省“头雁”团队（黑龙江省头雁行动领导小组文件 2019 5号）：北药基础与应用创新研究团队，负责人：匡海学。通讯作者：杨炳友，教授，博士研究生导师，主要研究方向：中药药效物质基础及其作用机制研究。4216 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药药效成分及质量评价1 材料 万分之一电子分析天平（AL204，梅特勒-托利多），超声波清洗器（KQ-250E，昆山超声仪器有限公司），高效液相色谱（型号：e2695；检测器型号：2998 PDA检测器，美国Waters科技有限公司）。15批怀牛膝经樊锐锋副教授鉴定（黑龙江中医药大学药学院）均为苋科科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，保存于黑龙江中医药大学中药化学实验室（产地见表1），水为超纯水，甲酸、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，-蜕皮甾酮（纯度98%，LOT：HR20625W5）、25R-牛膝甾酮（纯度95%，LOT：HR20924W3）、25S-牛膝甾酮（纯度98%，LOT：HR4229W4）均采购自宝鸡晨光生物科技有限公司，所购药材晾干，粉碎后过3号筛备用12。2 方法与结果 2.1色谱条件色 谱 柱 为 Waters SunFire C18（150 mm4.6 mm，5 m）；以 A：乙腈，B：0.1%甲酸水为流动相；梯度洗脱条件见表 2，检测波长设置为 280 nm；流速为1.0 mLmin-1；进样 10 L，柱温为 25，洗脱时间为70 min，理论板数按-蜕皮甾酮峰计算应不低于4000。2.2对照品溶液的制备称取-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮对照品适量，制成浓度分别为2.57、0.55、0.74 mgmL-1的对照品母液。分别精密量取-蜕皮甾酮对照品母液800 L，25S-牛膝甾酮对照品母液500 L，25R-牛膝甾酮对照品母液500 L，混合，定容至2 mL，摇匀，得到-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮浓度依次为1.14、0.15、0.21 mgmL-1的对照品溶液。2.3供试品溶液的制备精密称取怀牛膝粉末（过三号筛）5 g，置锥形瓶中，加水饱和正丁醇 30 mL，密塞，浸泡过夜，超声（功率300 W，频率40 kHz）30 min，滤过，用甲醇10 mL分数次洗涤容器及残渣，合并滤液和洗液，减压回收至干，以甲醇定容至1 mL，离心取上清液，过0.22 m滤膜，即得14。2.4方法学考察取河南省焦作市的怀牛膝药材粉末，按2.3项下方法制备供试品溶液；2.1项下色谱条件，以-蜕皮甾酮为参照峰，通过计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积对该方法重复性，仪器精密度以及样品稳定性进行考察。精密称取 6份，每份 5 g进行重复性考察，取其中一份连续测定6次进行精密度考察，并在室温条件下，分别于0、2、4、8、16、24 h时进行稳定性考察。其共有峰的相对保留时间RSD均2.0%，相对峰面积RSD均3.0%，说明该方法重复性良好，仪器精密度良好，样品溶液在室温条件下24 h内稳定。2.5怀牛膝指纹图谱的建立2.5.1指纹图谱相似度评价精密称取 15 批不同产地的怀牛膝药材粉末各5 g，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，提取记录各样品色谱图，并将15批样品的色谱图导入 中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）中，设S1号样品色谱图为参照图谱，时间窗宽度 0.10 min，采用中位数法，多点校正后得到15批怀牛膝药材HPLC图谱叠加图（图1），及对照指纹图谱（R）（图2）。共得到31个共有峰，计算各样品图谱与对照图谱的相似度结果为0.979、0.892、0.896、0.902、0.958、0.978、0.912、0.973、0.977、0.972、0.969、0.876、0.943、0.967、0.802由该相似度分析结果显示，11批样品的相似度大于0.900，其差异性较小，其中产地为河南省安阳市的S2、S3两批药材以及河南省驻马店市的S12、S15两批药材相似度小于0.900，说明不同产地中个别批次的怀牛膝药材成分具有一定的差异性15-16。表2梯度洗脱条件时间/min015355063646970流量/mLmin-11.001.001.001.001.001.001.001.00A%52027.539.562727295B%958072.560.53828285表115批怀牛膝药材来源编号S1S2S3S4S5S6S7S8产地河南省安阳市河南省安阳市河南省安阳市河南省安阳市河南省安阳市河南省焦作市河南省焦作市河南省焦作市采收时间2019100620191006201910062019100620191006201910022019100220191002编号S9S10S11S12S13S14S15-产地河南省焦作市河南省焦作市河南省驻马店市河南省驻马店市河南省驻马店市河南省驻马店市河南省驻马店市-采收时间20191002201910022019101020191010201910102019101020191010-4217 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 2.5.2共有峰的指认按2.2项下制备对照品溶液，2.1项下色谱条件对对照品溶液进行测定，将得到的色谱图（图3）与对照指纹图谱进行对比可知，峰13为-蜕皮甾酮，峰14为25R-牛膝甾酮，峰15为25S-牛膝甾酮。2.6三种指认成分含量测定2.6.1对照品溶液制备精密称取-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛图2怀牛膝药材对照指纹图谱(R)图115批牛膝药材样品指纹图谱4218 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药药效成分及质量评价膝甾酮对照品适量，至5 mL量瓶中，加甲醇定容，得到浓度依次为3.214、0.414、0.630 mgmL-1的混合对照品溶液。精密吸取对照品溶液适量，加甲醇定容，梯度稀释，共得到混合对照品溶液6份，见表3。2.6.2线性关系考察按2.1项下色谱条件对配制的混合对照品溶液进行测定，记录峰面积。以-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮进样量（mg）为横坐标（x），以峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归。其线性回归方程及线性范围见表4。2.6.3精密度取2.6.1项下制备的对照品溶液，按2.1项下色谱条件进行连续6次测定，积分获得-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面积，在 6 次测定下，3种成分的峰面积RSD均2.0%，说明仪器具有良好的精密度。2.6.4重复性取河南省焦作市的怀牛膝药材粉末6份，按2.3项下方法制备供试品溶液；2.1项下色谱条件进行重复性考察。积分获得-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面积。其6份样品中3种待测成分的峰面积RSD均3.0%，说明该方法的重复性良好。2.6.5稳定性取河南省焦作市的怀牛膝药材粉末6份，按2.3项下方法制备供试品溶液；2.1项下色谱条件，在室温条件下分别于0、2、4、8、16、24 h时进行稳定性考察，积分获得-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面积。其中 3种待测成分的峰面积RSD均1为标准，得到17个成分，结果见图7。按VIP值大小排序依次为2号峰、24号峰、16号峰、26号峰、5号峰、27号峰、19号峰、3号峰、23号峰、20号峰、17号峰、18号峰、31号峰、29号峰，21号峰、22号峰、28号峰。由此推测这17个共有峰所代表的化学成分可能是导致三个不同产地怀牛膝之间差异的主要变量，与聚类热图分析的差异性成分较为一致8。3 讨论 3.1色谱条件的优化现阶段对怀牛膝指纹图谱的研究中，共有峰鉴定数量较少，检测时间较长17且多需要变波长检测18，本图615批怀牛膝药材样品的PLS-DA图图715批怀牛膝31个共有峰的VIP值4222 Modern