HPLC测定拉洛他赛中醋酸残留量检测方法的建立与验证_王潞娜.pdf

第 51 卷第 3 期2023 年 2 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.3Mar.2023HPLC 测定拉洛他赛中醋酸残留量检测方法的建立与验证王潞娜,王红芳,宋荧荧,张 辉,柴青叶,宋小飞(山西振东制药股份有限公司,山西 长治 047100)摘 要:建立用外标法采用 HPLC 测定拉洛他赛原料中醋酸残留量的方法,并对其进行方法学验证。用 Agilent TC-C18色谱柱,以流动相 A 为 0.07%磷酸溶液-甲醇(950 50),流动相 B 为甲醇,等度洗脱,流速为 1.0 mL/min,柱温为 35,检测波长为 210 nm。醋酸在 4.0240 100.6000 g/mL 浓度范围内呈良好的线性关系(r=0.9999),醋酸平均回收率(n=9)为 99.5%,RSD为 1.13%。经方法学验证证明所建方法简便、灵敏、准确性高、重复性好且可靠,可以有效控制拉洛他赛原料中醋酸残留量。关键词:HPLC;拉洛他赛;醋酸;残留量中图分类号:R917 文献标志码:A文章编号:1001-9677(2023)03-0152-04 第一作者:王潞娜(1985-),女,助力工程师,研究方向为药品研发与质量研究。通讯作者:王红芳(1985-),女,工程师,研究方向为药品研发与质量研究。Establishment and Validation of HPLC Method for Determinationof Acetic Acid Residue in LalotaselWANG Lu-na,WANG Hong-fang,SONG Ying-ying,ZHANG Hui,CHAI Qing-ye,SONG Xiao-fei(Shanxi Zhendong Pharmaceutical Co.,Ltd.,Shanxi Changzhi 047100,China)Abstract:A method for the determination of acetic acid residue in raw materials of lalotaser by HPLC with externalstandard method was established,and its methodology was verified.Using Agilent TC-C18chromatographic column,themobile phase A was 0.07%phosphoric acid solution methanol(950 50),and the mobile phase B was methanol.Theflow rate was 1.0 mL/min,the column temperature was 35,and the detection wavelength was 210 nm.There was agood linear relationship in the concentration range of 4.0240 100.6000 g/mL of acetic acid(r=0.9999).Theaverage recovery of acetic acid(n=9)was 99.5%and RSD was 1.13%.The method was proved to be simple,sensitive,accurate,reproducible and reliable,and can effectively control the residue of acetic acid in the raw materialof lalotasal.Key words:HPLC;larotasai;acetic acid;residues拉洛他赛是国内外均未上市的新结构药物1,属于紫杉烷类抗肿瘤药2,通过与微管内表面蛋白结合使微管结构稳定3,抑制微管在正常有丝分裂过程中的解聚,从而使细胞滞留在晚期,导致细胞死亡4。紫杉醇是从植物红豆杉的树皮中提取的天然产物5-6,经临床证明具有良好的抗肿瘤作用7-8。局部晚期舌鳞状细胞癌患者术前采用白蛋白结合型紫杉醇进行辅助化疗9,可有效提高手术 R0 切除率10。科学家对此类化合物的构效关系、结构修饰、药理药效等方面开展了大量研究11。根据拉洛他赛合成工艺过程研究,可能存在的有机溶剂有乙醇、乙腈、醋酸等。根据各溶剂性质,依据 中国药典 四部项下 残留溶剂测定法12建立 2 套分析方法对残留溶剂进行控制,方法 1 为顶空进样法测定乙醇、乙腈等溶剂;方法 2为 HPLC 法测定醋酸残留量。目前,采用气相色谱法测定原料药中醋酸残留的报道较多,而采用 HPLC 测定残留溶剂的报道较少,而 HPLC 法具有分离效果高,检测灵敏度高,不受试样的挥发性和热稳定性限制等优点。本文采用 HPLC 法13对其醋酸残留量进行控制,为确保该方法准确、可靠,需对拟定的分析方法进行验证。1 仪器与试药Agilent 1260 高效液相色谱仪,二极管阵列检测器(DAD),美国安捷伦公司;TB-215D 型万分之一电子分析天平,北京赛多利斯仪器有限公司;MilliQ 超纯水机;安捷伦 TC-C18色谱柱(4.6 mm250 mm,5 m)、菲罗门 Super Lu-C18(4.6 mm250 mm,5 m)。醋酸对照品(规格 500 mL,批号 C2016056,含量 99.9%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;拉洛他赛(生产批号200701s),山西振东制药股份有限公司生产;甲醇(规格 4 L,批号 LDA0U87,色谱纯),北京白灵威科技有限公司;磷酸(规格 500 mL,批号 2020051901,分析纯),成都市科隆化学品有限公司。第 51 卷第 3 期王潞娜,等:HPLC 测定拉洛他赛中醋酸残留量检测方法的建立与验证153 2 方法与结果2.1 色谱条件安捷伦 TC-C18色谱柱(4.6 mm250 mm,5 m);检测波长为210 nm;柱温为35;流速为1.0 mL/min;进样量为10 L;流动相 A 为 0.07%磷酸溶液-甲醇(950 50);流动相 B 为甲醇;按表 1 进行梯度洗脱。表 1 按下表进行梯度洗脱Table 1 Gradient elution is carried out according to thefollowing table时间/min流动相 A/%流动相 B/%0100061000815851515851710002510002.2 溶液配制空白溶剂:80%甲醇。对照品母液的制备:称取醋酸对照品约 0.5 g,精密称定,置 50 mL 量瓶中,加 80%甲醇稀释并定容至刻度,摇匀;精密量取1 mL,置100 mL 量瓶中,用80%甲醇稀释至刻度,摇匀,制成 100 g/mL 的对照品母液。对照品溶液的制备:精密量取对照品母液 5 mL,置 10 mL量瓶中,用80%甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,制成 50 g/mL的对照品溶液。系统适用性溶液的制备:取拉洛他赛约 0.1 g,精密称定,置 10 mL 量瓶中,加入 80%甲醇适量使其溶解,再精密加入对照品母液 5 mL,用 80%甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,制成含拉洛他赛 10 mg/mL、醋酸 50 g/mL 的系统适用性溶液。醋酸定位溶液:精密量取对照品贮备液 5 mL,置 10 mL 量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,制成含醋酸 50 g/mL 的溶液。供试品溶液:取本品约 0.1 g,精密称定,置 10 mL 量瓶中,用溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀,制成 10 mg/mL 的供试品溶液。2.3 系统适用性与专属性试验取 2.2 项下空白溶剂、系统适用性溶液、醋酸定位溶液、供试品溶液、对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,记录色谱图,见图 1 图 4。图 1 空白溶剂色谱图Fig.1 Chromatogram of blank solven图 2 系统适用性溶液色谱图Fig.2 System suitability solution chromatogram图 3 醋酸定位溶液色谱图Fig.3 Chromatogram of acetic acid positioning solution图 4 供试品溶液色谱图Fig.4 Chromatogram of test solution结果表明,空白溶剂不干扰主峰及醋酸测定;系统适用性溶液中主峰与醋酸之间分离度为 36.40,大于 2.0,分离度良好;对照品溶液连续进样 5 次,醋酸峰面积 RSD(n=5)为0.48%,小于 5.0,保留时间 RSD(n=5)为 0.05%,小于1.0%,说明仪器精密度良好。2.4 检测限定量限取醋酸对照品适量,配制一定浓度的贮备液,用 80%甲醇溶解并逐步稀释制成一定浓度的溶液,以信噪比 10 1 时的浓度为定量限,以信噪比 3 1 时的浓度为检测限,按“2.1”项下色谱条件进行测定;结果见表 2。表 2 灵敏度试验结果Table 2 Sensitivity test results项目定量限检测限相对供试品百分数表示/%定量限/ng相对供试品百分数表示/%检测限/ng醋酸0.04400.0112S/N16.044.81结果表明,检测限及定量限在该浓度下信噪比均符合要求,定量限小于报告限度的 0.5 倍(相当于供试品 0.05%),且能被准确被检测,说明灵敏度良好。2.5 线性试验取醋酸对照品适量,用 80%甲醇逐步稀释成浓度分别为4.0240 g/mL、15.0900 g/mL、25.1500 g/mL、40.2400 g/mL、50.3000 g/mL、100.6000 g/mL 的一系列溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标进154 广 州 化 工2023 年 2 月行线性回归,结果见表 3。表 3 线性试验结果Table 3 Linear test result名称浓度/(gmL-1)百分含量/%峰面积标准残差线性溶液 14.02400.041.51-0.7651线性溶液 215.09000.155.24-0.4774线性溶液 325.15000.258.690.1970线性溶液 440.24000.4013.750.4052线性溶液 550.30000.5017.261.4989线性溶液 6100.60001.0133.69-0.8585相对剩余标准差/%1.18回归方程y=0.33468x+0.19347相关系数 r0.9999y 轴截距占 100%浓度峰面积百分比/%1.12结果表明,醋酸在相应浓度范围内与峰面积线性关系良好。2.6 准确度试验取醋酸对照品适量,用80%甲醇溶解,稀释制成100 g/mL的对照品母液。取本品约 0.1 g,精密称定,置 10 mL 量瓶中(共 9 份),分别精密加入对照品母液 2.5 mL(3 份)、5 mL(3 份)、7.5 mL(3 份),置上述 9 个量瓶中,用 80%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。按“2.1”项下色谱条件对其进行测定。结果,9 份平均回收率为 99.5%,RSD 为 1.13%,该方法准确度较高。2.7 重复性试验空白溶剂:80%甲醇。由于本品中未检出醋酸,故在重复性项下采用未加标与加标 2 种方法对重复性进行考察。2.7.1 未加标重复性对照品溶液:取醋酸约 0.5 g,精密称定,置 100 mL 量瓶中,用80%甲醇稀释至刻度,摇匀;精密量取 1 mL,置 100 mL量瓶中,用 80%甲醇稀释至刻度,摇匀,制成 50 g/mL 的对照品溶液,平行配制 2 份。供试品溶液:取本品约 0.1 g,精密称定,置 10 mL 量瓶中,加80%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度为10 mg/mL的供试品溶液,平行配制 6 份。结果,6 份供试品溶液中醋酸均