斑马鱼软骨内骨化过程中骨骼的转录组测序分析_于茜.pdf

第 38 卷第 1 期大 连 海 洋 大 学 学 报大 连 海 洋 大 学 学 报Vol.38 No.12 0 2 3 年 2 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYFeb.2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-077文章编号:2095-1388(2023)01-0095-09斑马鱼软骨内骨化过程中骨骼的转录组测序分析于茜,高静,纪晓,Adelino Canario,陈洁(上海海洋大学 国家海洋生物科学国际联合研究中心,水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306)摘要:为研究斑马鱼(Danio rerio)骨骼发育时期关键调控基因及复杂的调控网络,采用阿尔辛蓝-茜素红双重染色方法对受精后 50 d(day post fertilization,dpf)和 65 dpf 野生型斑马鱼骨骼进行染色,提取 50 dpf和 65 dpf 斑马鱼骨骼的总 RNA 进行转录组测序,对差异表达基因进行筛选并进行 GO 功能注释和 KEGG 富集分析。结果表明:50 dpf 斑马鱼头骨正在经历软骨内骨化,而 65 dpf 斑马鱼软骨内骨化过程基本完成;对 50 dpf 与 65 dpf 斑马鱼骨骼进行转录组测序,共产生 41.44109个有效数据,存在 610 个差异表达基因,相比 50 dpf 斑马鱼,65 dpf 斑马鱼骨骼中软骨发育相关基因(dlx2a、foxd3 和 sec23b)、骨矿化调节基因(ptk2bb)、骨骼细胞分化正调控基因(dlx2a)均下调,表明其骨骼发育已较为成熟,骨细胞分化过程减少,与阿尔辛蓝-茜素红双重染色结果相一致;进一步对这些差异表达基因进行 GO 功能注释和 KEGG 富集分析,发现大部分差异表达基因与代谢网络、生殖信号通路相关;随机选取了 6 个差异表达基因进行实时荧光定量 qRT-PCR 验证,发现这些基因表达趋势与测序结果一致,这表明转录组测序结果真实可信。研究表明,鱼类与哺乳动物一样,其代谢、骨骼和生殖功能三者间存在密切联系,其内在机制为研究斑马鱼骨骼发育与疾病治疗提供了一个新的思路。关键词:斑马鱼;骨骼;软骨内骨化;转录组测序;GO 功能注释;KEGG 富集分析中图分类号:S 917.4 文献标志码:A 斑马鱼(Danio rerio)是研究骨骼发育与疾病的良好模型1。以往骨骼疾病研究通常是在小鼠中进行,但小鼠繁育周期长且产仔量少,加上动物试验 3R 原则的出现,促使科研工作者的视线聚焦到了斑马鱼上1。斑马鱼骨骼与哺乳动物骨骼细胞类型相同,包含骨细胞、成骨细胞和破骨细胞 3种细胞类群;成骨方式相似,具有膜内骨化和软骨内骨化两种成骨方式;骨骼稳态的保持也相似,依赖骨吸收和骨形成的协同调控2。斑马鱼骨骼发育的分子调控机制也非常保守,哺乳动物中骨骼发育的关键调控因子 runx2、osx 和 osn 等在斑马鱼中高度同源且功能相似3。哺乳动物中已知的与骨骼发育紧密相关的信号通路如 Wnt/-catenin、Hedgehog、TGF-等在斑马鱼中也发挥同样作用4-6。研究者已构建了多种斑马鱼骨骼疾病模型,如斑马鱼骨质疏松症模型,也为研究骨骼疾病提供了新的思路7。骨骼不仅能够给动物机体提供支撑,与骨骼肌一起协助机体完成复杂的运功,还具有强大的内分泌功能。骨骼能分泌多种生物活性因子,以旁分泌或自分泌的方式调控骨骼的发育和代谢过程8,其分泌的多种生物活性物质还可经循环系统参与调节机体内多种组织器官的代谢和功能。如成骨细胞分泌的骨钙素可直接作用于胰岛 细胞,调节其糖代谢过程9,也能增加脂质的利用从而减少脂肪的堆积。此外,成骨细胞还是雌激素的主要靶标,雌激素水平降低会间接激活破骨细胞分化,使破骨细胞主导的骨吸收大于成骨细胞主导的骨形成过程,最终导致骨质疏松10。骨骼系统的稳态受到内分泌和旁分泌的协同调控,一些内分泌调控因子,如甲状腺激素、降钙素、性激素等,以及一些旁分泌调控因子如前列腺素和生长因子等的异常都 收稿日期:2022-03-16 基金项目:上海海洋大学水产一流学科支持项目(A1-3201-19-3020);上海市科委“一带一路”国际联合实验室项目(19590750500)作者简介:于茜(1997),女,硕士研究生。E-mail:1847629680 通信作者:陈洁(1986),女,博士。E-mail:chenjie 会破坏骨重建稳态,从而诱发骨骼疾病8。由于骨骼疾病受机体复杂调控网络的影响,骨骼疾病的治疗始终是个难题,再加上现有研究大多致力于如何降低骨吸收过程,缺少对骨形成过程的利用,因此,对活体骨骼进行详尽研究就显得至关重要11。目前,以斑马鱼作为骨骼疾病研究模型的相关研究较多,但一些关键时期骨骼发育模式和调控机制及调控网络还有待深入探究。斑马鱼骨骼从受精后 3 d(day post fertilization,dpf)开始发育,在30 dpf 左右时脊椎骨骼基本形成,70 dpf 左右时所有头骨骨骼基本形成,一直到 34 个月时斑马鱼骨骼发育完全成熟。在 3070 dpf 时,斑马鱼的骨骼发育正在经历软骨内骨化的过程,而这一过程的分子调控机制尚不清楚。在 NCBI 数据库中已有在30 45 dpf 对斑马鱼进行转录组测序的结果。在4570 dpf 时,骨骼仍在经历软骨内骨化过程,但缺乏转录组测序分析的报道。本研究中,选择斑马鱼两个时间点(50 dpf 和 65 dpf)的骨骼进行转录组测序,以期挖掘更多骨骼发育的关键基因,丰富斑马鱼软骨内骨化过程中骨发育的分子调控网络,为骨骼疾病的治疗提供新思路。1 材料与方法1.1 材料试验用斑马鱼为 AB 品系,购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,并根据上海海洋大学动物伦理委员会的要求进行处理,按照斑马鱼养殖标准饲养。试验用鱼均等密度养殖于循环养殖系统(Aquaneering Inc,San Diego,CA,USA),水温控制在 2728,盐度为 0.250.75,pH 为 7.08.0,氨氮及硝态氮质量浓度不超过200 mg/L,光照条件处理为14 h 照明交替10 h 黑暗。1.2 方法1.2.1阿尔辛蓝-茜素红双重染色取 50 dpf 和65 dpf 斑马鱼样品,用体积分数为 4%的多聚甲醛(PFA)在 4 冰箱固定 48 h。将 PFA 吸出,样品用 1PBST 清洗两次,每次 5 min,在 1%(质量分数)KOH 和 5%(质量分数)H2O2的混合液(二者体积比为 1 1)中,自然光下漂白 2 h,直到鱼眼呈淡黄色。加入体积分数为 0.05%的阿尔辛蓝避光 染 色 24 h,移 去 染 色 液,用 体 积 分 数 为100%、70%、50%、30%的乙醇和 1PBST 清洗样品,每次清洗 30 min。用质量分数为 0.1%的胰蛋白酶消化过夜,移去消化液,用 1PBST 清洗两次,每次 30 min。再用 0.5%的 KOH 配制成 0.5%的茜素红溶液,染色 1 h,待硬骨染成红紫色时,用体积分数为 25%、50%、75%的甘油保存,待样品透明后,再置换于体积分数为 100%的甘油溶液中保存。1.2.2斑马鱼骨组织解剖与获取从斑马鱼全身骨骼中获取测序使用的骨组织,包括头骨、脊椎骨和鱼鳍等。具体如下:分别取50 dpf 和65 dpf 的斑马鱼,使用 1MS222 进行麻醉,将其固定在泡沫板上剥去鱼皮,用手术刀和镊子切除内脏,再将头部和身体分离,置于解剖镜下将肌肉组织剔除,再将取出的斑马鱼骨骼组织置于质量分数为 0.1%的胰蛋白酶溶液中,37 下水浴消化残存肌肉,并于解剖镜下确认肌肉消化程度,以确保获取组织仅为斑马鱼骨组织。反应结束后,使用 1PBS 缓冲液反复润洗骨组织。将采集的骨组织样本立即放入液氮中速冻,于-80 超低温冰箱中保存待用。1.2.3 骨组织总 RNA 提取及转录组测序 取适量的骨组织样品,用试剂盒(mirVanaTM miRNA ISO-lation Kit,Ambion-1561)进行 RNA 提取,用 Nan-oDrop 2000 检测 RNA 浓度,用 Agilent 2100 Bioana-lyzer 生物分析仪检测 RNA 质量(RIN7 且 28S/18S0.7),样品总 RNA 使用 DNase 消化 DNA 后,再用带有 Oligo(dT)的磁珠富集 mRNA,加入打断试剂将 mRNA 打断成短片段,用打断后的 mRNA为模板合成一链 cDNA,然后继续合成二链 cDNA,并使用试剂盒纯化双链 cDNA,纯化的双链 cDNA进行末端修复再加 A 尾并连接测序接头,然后进行片段大小选择,最后进行 PCR 扩增。将构建好的文库经 Agilent 2100 Bioanalyzer 质检合格后,使用 Illumina HiSeq X Ten 测序平台进行测序,产生150 bp 的双端数据。1.2.4 转录组数据分析通过 Illumina 平台得到大量的样本双端测序数据,测序中产生大量原始数据(raw reads)。为获得可用于后续分析的高质量reads,需要对 raw reads 进行过滤。首先使用 Trim-momatic 软件进行质量检测并去除接头,过滤掉低质量碱基,获得高质量的 clean reads12。再使用Hisat 2 软件将 clean reads 比对到斑马鱼的参考基因组,并通过基因组比对率来评估样本的情况13。使用 Cufflinks 软件定量基因 FPKM 表达量值14,在计算基因的表达量差异时,通过 Htseqcount 软件获取落到各个样本中基因的 reads 数目15,利用69大连海洋大学学报 第 38 卷DESeq(2012)R Package 对数据进行标准化,并用 NbinomTest 函数计算差异比较的 P 值和 fold change 值,使用 DESeq(2012)R 软件进行差异表达分析16,将 log2(fold change)1 且 P0.05设置为显著差异表达的阈值。对差异表达基因(DEG)进行分层聚类分析,以证明不同组样本中基因的表达模式。基于超几何分布分别对 DEGs 进行 GO(gene ontology)富集和 KEGG(kyoto ency-clopedia of genes and genomes)途径富集分析,以分析差异基因主要影响的生物学功能或通路17。1.2.5 荧光定量 PCR(qRT-PCR)分别取 50 dpf和 65 dpf 的斑马鱼各 3 尾提取骨骼组织总 RNA。使用试剂盒(TaKaRa,RR047A)将 RNA(1 g)反转录成 cDNA,并保存于-80 超低温冰箱中。qRT-PCR 所用引物在 NCBI 网站设计(表 1),所有引物扩增效率均为 90%105%。以 cDNA 为模板、-actin 为内参进行荧光定量检测。反应条件:95 下变性 10 s,60 下退火 30 s,72 下延伸1 min,共进行 40 个循环。荧光定量数据采用2-Ct法进行计算,最后使用 Prism 6.0 软件作图。表 1 qRT-PCR 引物信息Tab.1 qRT-PCR primer information基因 gene引物序列 primer sequence(5-3)ucmabF:TCTCAACCACAAGCCTCACAACATCR:CAAGCAGACAGGTGAGAAGAGCAGcompF:ATGATGCTGATGGCGATGGGATTCR:TTCACCAGACGGCAGTTATCACAAGsox9bF:CAGACGGAGGAAATCAGTGAAGAGCR:GTGCTGGAGTCGGGTGTTTCTGzp2.2F:GGACCTGACTGTGAAGCCATCAACR:GCACTGTAACATCTCTAGCCACCACSi:ch1073-365p7.2F:GAGAGAGTTCAGCAGATGGGAAAGCR:TTCTAGCCACATCTCA